佟廣香 唐國盤 徐 偉 張永泉 尹家勝 匡友誼

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所, 黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150070;2. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院, 鄭州 450046)

哲羅鮭Hucho taimen(Pallas)隸屬鮭形目(Salmoniformes)、鮭科(Salmonidae)、哲羅魚屬(Hucho),是我國珍稀名貴冷水性魚類之一, 肉質(zhì)細(xì)嫩, 味道鮮美[1]。1998年哲羅鮭被列入中國瀕危動(dòng)物紅皮書[2,3]。近年來哲羅鮭的資源量不斷下降, 已經(jīng)很難見到野生群體[4—8], 2004年被列入中國物種紅色名錄。

哲羅鮭是鮭科魚類中個(gè)體最大的魚類, 生長迅速, 抗病力強(qiáng), 營養(yǎng)價(jià)值高, 養(yǎng)殖條件與虹鱒類似, 是優(yōu)秀的養(yǎng)殖對(duì)象[5,9]。在養(yǎng)殖條件下, 哲羅鮭需要4—5年才能初次性成熟, 性成熟前, 無法通過外形來判斷其性別; 在性成熟后, 由于生活環(huán)境不同, 婚姻色存在差異, 也很難通過婚姻色鑒定雌、雄[1,10,11]。哲羅鮭雌魚懷卵量大, 魚卵可用于加工魚子醬, 因此單性養(yǎng)殖和性別控制育種具有較高的應(yīng)用價(jià)值。怎樣快速、準(zhǔn)確并在幼魚期鑒定哲羅鮭遺傳性別, 指導(dǎo)養(yǎng)殖過程中雌、雄比例,有目的的養(yǎng)殖, 節(jié)約養(yǎng)殖成本, 成為制約哲羅鮭產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。本研究根據(jù)虹鱒Y染色體特異性序列, 從哲羅鮭基因組草圖中篩選出性別特異性標(biāo)記, 并建立準(zhǔn)確的性別鑒定方法, 為哲羅鮭的性別分化研究、性別控制育種和單性養(yǎng)殖等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及DNA提取

本研究材料來源于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚試驗(yàn)站。繁殖時(shí)鑒定雌、雄, 采集雌、雄魚各48尾鰭條貼在濾紙上陰干。取0.2—0.4 cm2的鰭條樣本, 用100 μL裂解液[裂解液成分: 蛋白酶K 0.5 mg/mL、1 mol/L Tris(pH8.0)10 mmol/L、KCl 50 mmol/L、0.3%Tween 20、0.3% NP 40]在PCR板內(nèi)裂解樣本, 裂解程序?yàn)?5℃ 2—4h, 98℃ 10min。樣本裂解后采用Vortex儀混勻, 混勻后1000—2000 r/min離心1—2min, 取上清液作為PCR擴(kuò)增模板。

1.2 序列分析及引物設(shè)計(jì)

從NCBI下載虹鱒Y染色體序列(EU081756.1),采用BLAT程序在哲羅鮭基因組草圖中搜索出同源序列。用Primer 3在同源序列上設(shè)計(jì)性別特異性引物, 并在哲羅鮭線粒體12S rRNA序列上設(shè)計(jì)參照引物。參照引物用于消除非特異性擴(kuò)增、樣本降解及加樣失誤等因素的影響。引物序列及退火溫度見表1。

表1 引物列表Tab. 1 Primer list

1.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為: 2×PCR Dream Taq master mix(Thermo Fisher, USA)10 μL, 樣本DNA裂解上清液2 μL, 10 μmol/L的上下游引物各0.1—1 μL,超純水補(bǔ)足20 μL。PCR程序設(shè)置為95℃變性3min;30個(gè)循環(huán), 每個(gè)循環(huán)設(shè)置為95℃ 30s, 退火(退火溫度見表1)30s, 72℃ 30s; 最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物分別用2%瓊脂糖凝膠電泳和8%的非變性聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)。將特異性引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、回收, 克隆至pMD18-T載體, 處理后, 轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中, 篩選含有陽性插入片段的菌落進(jìn)行測(cè)序。

1.4 引物濃度優(yōu)化

本研究利用哲羅鮭基因組中與虹鱒Y染色體同源的序列設(shè)計(jì)性別鑒定引物, 在理想情況下, 雌性樣本中無擴(kuò)增條帶, 而實(shí)際檢測(cè)過程中樣本DNA降解、加樣失誤、PCR擴(kuò)增失敗等原因也會(huì)導(dǎo)致無擴(kuò)增條帶。為消除此類問題的影響, 本研究引入了線粒體12S rRNA作為參照, 將性別特異性引物和12S rRNA引物在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系內(nèi)擴(kuò)增, 在參照引物有條帶的前提下, 用特異性引物有無條帶鑒定雌、雄。由于不同引物擴(kuò)增效率存在差異, 因此需要對(duì)性別特異性引物和12S rRNA引物濃度比例進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化時(shí)設(shè)置4個(gè)濃度梯度, 在20 μL擴(kuò)增體系內(nèi)10 μmol/L的性別特異性引物上下游各1 μL,而10 μmol/L的12S rRNA參照引物上下游體積分別為1、0.5、0.25和0.1 μL。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選

用雌、雄魚各3尾樣本初步篩選3對(duì)性別特異性引物和12S rRNA參照引物。由圖1可知, 在性別特異性引物中, 引物ST1在雌、雄魚樣本中均能擴(kuò)增出133 bp條帶; 引物ST2在雌魚樣本中無擴(kuò)增條帶, 在雄魚樣本中能擴(kuò)增出153 bp條帶; 引物ST3在雌、雄魚樣本均能擴(kuò)增出182 bp條帶。12S rRNA參照引物在雌、雄魚中均能擴(kuò)增出251 bp條帶。此結(jié)果表明, 引物ST2可能是哲羅鮭雄魚特異性標(biāo)記。

圖1 4對(duì)引物PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig. 1 Electrophoresis of PCR products using four pairs of primers

2.2 PCR引物濃度優(yōu)化

為提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率, 節(jié)約檢測(cè)成本和時(shí)間,本研究采用雙重PCR進(jìn)行性別鑒定。由于不同引物的擴(kuò)增效率存在差異, 因此需要對(duì)性別特異性引物和12S rRNA參照引物的濃度比例進(jìn)行優(yōu)化。在20 μL擴(kuò)增體系內(nèi)10 μmol/L的引物ST2固定為1 μL,而10 μmol/L的12S rRNA參照引物體積分別為1(圖2A)、0.5(圖2B)、0.25(圖2C)和0.1 μL(圖2D)。由圖2可知, 引物ST2和12S rRNA的4組比例均能擴(kuò)增出條帶, 且隨著12S rRNA引物濃度的降低, 12S rRNA擴(kuò)增條帶亮度呈下降趨勢(shì), 引物ST2擴(kuò)增條帶亮度呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。當(dāng)引物ST2為1 μL, 12S rRNA為0.25 μL時(shí)(圖2C), 二者條帶亮度達(dá)到平衡, 條帶均比較清晰。因此在哲羅鮭性別鑒定中引物ST2和12S rRNA引物濃度比例設(shè)置為1∶0.25。

圖2 引物ST2和12S rRNA雙重PCR擴(kuò)增瓊脂糖電泳圖譜Fig. 2 Electrophoresis of duplex PCR products using ST2 and 12S rRNA primers

2.3 性別特異性標(biāo)記鑒定

為驗(yàn)證引物ST2的有效性, 進(jìn)一步用雌、雄魚各48尾樣本評(píng)估引物ST2的準(zhǔn)確性。48尾雌、雄魚樣本擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖3, 聚丙烯凝膠電泳圖譜見圖4。引物ST2在雌魚中均無擴(kuò)增條帶, 在雄魚中均能夠擴(kuò)增出153 bp的單一條帶;12S rRNA參照引物在雌、雄樣本中均能擴(kuò)增出251 bp條帶。12S rRNA參照引物能夠擴(kuò)增出條帶表明雌魚樣本條帶缺失并不是由于PCR擴(kuò)增失敗、加樣失誤和DNA降解等原因造成的, 而是由雌、雄樣本間基因組DNA差異造成的。鑒于以上結(jié)果, 引物ST2可以作為哲羅鮭雄性特異性標(biāo)記, 用于性別鑒定。引物ST2在檢測(cè)的48尾雌、雄魚樣本中, 性別鑒定準(zhǔn)確率可達(dá)100%。

圖3 引物ST2和12S rRNA1組合雌、雄樣本的瓊脂糖電泳圖譜Fig. 3 Electrophoresis of duplex PCR products using ST2 and 12S rRNA primers in female and male samples

圖4 引物ST2和12S rRNA1組合雌、雄樣本的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig. 4 Non-denaturing PAGE electrophoresis of duplex PCR products using ST2 and 12S rRNA primers in female and male samples

2.4 雄性特異性基因篩選

將引物ST2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、回收, 克隆至pMD18-T載體, 處理后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中,篩選含有陽性插入片段的菌落進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序獲得153 bp序列(5′-TGTCAGGGTTGATTACAGTTCC TAAGGCATTTGCATTTTATCTCATGGTAGTGGTTG TGTCCTGCAGCCTCCCAACAGCCTTGTCGTT CTGTGGAGTTCATGTGGGATGTATATCAATCA TGGCTGGAGGTGTGATGAGGAATCAGACTG CAG-3′)。將該序列與哲羅鮭基因組(未發(fā)表)對(duì)比發(fā)現(xiàn), 此序列與sdY基因位于同一Scaffold上, 并與sdY基因相鄰。除此之外, 還將該序列與哲羅鮭的近源物種多瑙河哲羅鮭(Hucho hucho)基因組進(jìn)行了對(duì)比, 結(jié)果顯示此序列在多瑙河哲羅鮭基因組中存在2個(gè)拷貝, 分別位于QNTS01001159.1的ENSH HUG00000033926(lrp4-1)基因內(nèi)和QNTS01000029.1的ENSHHUG00000034142(lrp4-2)內(nèi), 并與這2個(gè)基因7號(hào)外顯子匹配90 bp。

3 討論

魚類是低等脊椎動(dòng)物, 進(jìn)化相對(duì)原始, 由于大多數(shù)魚類的性染色體還處于未分化或者分化的早期階段, 因此很難通過性染色體的形態(tài)來辨別雌、雄。另外, 魚類胚胎發(fā)育過程中易受環(huán)境(特別是溫度)影響, 常導(dǎo)致魚類的表型性別(卵巢或精巢)和遺傳性別(基因型)不一致[12—16], 因此需要一種準(zhǔn)確、快捷的方法來鑒定魚類的遺傳性別。分子標(biāo)記是一種可以在DNA水平上直接反映基因組差異的方法, 與形態(tài)學(xué)標(biāo)記[17,19]、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和生物化學(xué)標(biāo)記相比[20—23], 具有準(zhǔn)確、快捷及數(shù)量豐富等優(yōu)越性。目前多種鮭科魚類已經(jīng)篩選出了性別相關(guān)的分子標(biāo)記。如: Devlin等[24]篩選出大馬哈魚Y染色體上特異的DNA片段, 該片段可用來鑒定大馬哈魚遺傳性別; Yano等[25]發(fā)現(xiàn)了一種免疫相關(guān)基因進(jìn)化成為虹鱒主要性別決定基因; Felip等[26]通過擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)方法, 獲得了一些虹鱒性別特異分子標(biāo)記。哲羅鮭也是鮭科魚類, 但性別相關(guān)的分子標(biāo)記尚未見報(bào)道。本研究成功獲得了哲羅鮭雄性特異性的分子標(biāo)記, 可以100%區(qū)分哲羅鮭的遺傳性別, 且僅用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)就能獲得結(jié)果,方法簡單, 易于操作。

在鮭科魚類中, 基因sdY[25,27]是虹鱒、大西洋鮭和多瑙河哲羅鮭等15個(gè)不同物種的性別決定基因。本研究獲得的153 bp序列與sdY基因在哲羅鮭基因組草圖中位于同一Scaffold上, 與sdY基因相鄰。將這153 bp序列與多瑙河哲羅鮭基因組對(duì)比,發(fā)現(xiàn)此序列屬于lrp4基因的部分序列。lrp4基因是低密度脂蛋白受體4, 其主要功能是調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇平衡, 是膽固醇運(yùn)輸?shù)闹饕d體, 也有報(bào)道表明lrp4基因在小鼠胚胎發(fā)育E13和E14時(shí)期的睪丸中顯著高表達(dá)[28],lrp4是否為哲羅鮭Hucho taimen的性別決定基因, 還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

哲羅鮭屬大型魚類, 商品魚養(yǎng)殖2—3年可上市,但需要4—5年才能初次性成熟。哲羅鮭在養(yǎng)殖過程中雌、雄魚生長差異不大, 但在人工繁殖過程中1尾雄魚的精液可以配多尾雌魚, 因此雌、雄魚的比例為2∶1就可以滿足繁殖需求, 養(yǎng)殖過多的雄性親魚造成不必要的浪費(fèi)。同時(shí)哲羅鮭雌魚懷卵量大, 可用來生產(chǎn)魚籽醬, 單性別養(yǎng)殖具有重大意義。本研究建立的哲羅鮭遺傳性別鑒定方法, 能夠很好地解決生產(chǎn)需求, 可在養(yǎng)殖場(chǎng)簡易的實(shí)驗(yàn)條件下, 幼魚期采集少量鰭條進(jìn)行無損傷的早期性別鑒定, 實(shí)現(xiàn)有計(jì)劃有目的養(yǎng)殖, 使養(yǎng)殖者獲得最大的效益。本方法在哲羅鮭育種方面也具有很大的應(yīng)用價(jià)值, 通過此方法可實(shí)現(xiàn)哲羅鮭的單性養(yǎng)殖及性別控制育種, 為哲羅鮭的全雌或全雄育種奠定基礎(chǔ)。