王珂雯，廖小軍，徐貞貞

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

食品的組成成分復(fù)雜，既包括碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)素，還包括多酚、多糖、萜類等活性成分[1]。各組分之間在生產(chǎn)、加工和貯藏等過程中時(shí)刻發(fā)生著相互作用，這些作用對(duì)食品的顏色、香氣、味道、形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)等屬性有較大影響，因此，食品組分間的相互作用是食品科學(xué)研究領(lǐng)域的核心問題之一[2]。目前，國內(nèi)外學(xué)術(shù)界對(duì)食品組分的相互作用尚未明確的定義，研究人員往往針對(duì)不同的食品組分開展研究[3]。本研究以“Food compound”、“Interaction”、“Polyphenol”、“Protein”、“Lipid”、“Carbohydrate”、“Polysaccharide”、“Oligose”、“食品組分”、“相互作用”、“食品成分”、“多酚”、“蛋白質(zhì)”、“脂質(zhì)”、“碳水化合物”、“多糖”、“寡糖”為關(guān)鍵詞，在Google Scholar、Web of Science、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫檢索近五年（2016～2020年）的文獻(xiàn)，其中158 篇文獻(xiàn)研究了食品組分間的相互作用，具體為“多酚-蛋白質(zhì)”、“多酚-多糖”、“風(fēng)味物質(zhì)-蛋白質(zhì)”、“多糖-蛋白質(zhì)”等的相互作用，其中研究多酚-蛋白質(zhì)相互作用的文獻(xiàn)數(shù)目占比達(dá)三分之一以上，是目前食品組分間相互作用的研究熱點(diǎn)（圖1）[4]。

圖1 近五年食品組分相互作用文獻(xiàn)數(shù)目Fig.1 Number of literatures on food compound interaction in the past five years

就分子相互作用而言，可按照分子量大?。ǚ肿恿啃∮?000 Da 的為小分子，大于1000 Da 的為大分子[5]），將研究對(duì)象體系分為小分子和小分子、小分子和大分子、大分子和大分子三類；也可按照相互作用力的類型，分為非共價(jià)作用力（氫鍵、疏水相互作用、范德華力、靜電相互作用等）和共價(jià)作用力（σ 鍵、π 鍵、肽鍵、二硫鍵等）[6]。多酚-蛋白質(zhì)的相互作用屬于小分子和大分子的相互作用，且同時(shí)存在非共價(jià)作用力和共價(jià)作用力，其中，非共價(jià)作用力是由氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用、范德華力等形成，對(duì)應(yīng)的是可逆過程[7?9]；共價(jià)作用力主要是肽鍵和二硫鍵，對(duì)應(yīng)的是不可逆過程[10?11]。對(duì)于多酚-蛋白質(zhì)相互作用的研究，可以采用直接和間接兩種方式進(jìn)行（圖2）：直接方式包括使用熒光發(fā)射光譜法、傅里葉變換紅外光譜法、圓二色光譜法、核磁共振光譜法等分析多酚-蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物，或直接測(cè)定蛋白質(zhì)[12]和多酚的含量變化[13]；間接方式包括使用等溫量熱滴定法、差示掃描量熱法計(jì)算多酚-蛋白質(zhì)結(jié)合過程中的熱力學(xué)參數(shù)，或使用小角度散射、濁度法、動(dòng)態(tài)光散射法等研究多酚使蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生改變的過程，或使用分子對(duì)接、分子動(dòng)態(tài)模擬的方法，預(yù)測(cè)多酚-蛋白質(zhì)結(jié)合模式，從而間接證明相互作用的存在[14?15]。單獨(dú)使用某一種分析方法只能為研究多酚-蛋白質(zhì)的相互作用提供補(bǔ)充證據(jù)，針對(duì)相互作用機(jī)制的研究常集合多種方法系統(tǒng)解析多酚-蛋白質(zhì)的相互作用[15?16]。

圖2 多酚-蛋白質(zhì)相互作用分析方法Fig.2 Analysis methods of polyphenol-protein interaction

本文按照直接和間接方式歸納了目前應(yīng)用于多酚-蛋白質(zhì)相互作用的研究方法，并列舉了這些技術(shù)在研究多酚-蛋白質(zhì)相互作用中的特點(diǎn)和實(shí)例，以期為食品科學(xué)領(lǐng)域中多酚-蛋白質(zhì)相互作用的相關(guān)研究工作提供技術(shù)支撐，為研究其它食品組分間的相互作用提供參考。

1 多酚-蛋白質(zhì)相互作用的直接分析方式

1.1 熒光光譜法

熒光光譜法廣泛用于研究多酚-蛋白質(zhì)的相互作用。蛋白質(zhì)含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基，具有固有的發(fā)射熒光[17]，當(dāng)多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合后，會(huì)造成蛋白質(zhì)固有熒光的淬滅，通過Stern-Volmer 公式計(jì)算出淬滅類型，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，進(jìn)一步通過Van’t Hoff 公式計(jì)算出焓變和熵變，判斷作用力類型。Dai 等[18]借助該方法研究了B 型-原花青素二聚體和水稻谷蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)B 型-原花青素二聚體水平增加時(shí)，水稻谷蛋白的熒光強(qiáng)度明顯降低，并且最大峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)只有輕微的變化（約2 nm），這些結(jié)果表明，B 型-原花青素二聚體淬滅了水稻谷蛋白的固有熒光，表明兩者發(fā)生相互作用。在小分子-蛋白質(zhì)相互作用的研究領(lǐng)域，同步熒光光譜經(jīng)常用來研究環(huán)境對(duì)熒光基團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響[18]。當(dāng)Δλ=15 nm 時(shí)，同步熒光光譜顯示酪氨酸殘基的特征熒光；當(dāng)Δλ=60 nm 時(shí)，同步熒光光譜顯示色氨酸殘基特征熒光，而蛋白質(zhì)的氨基酸酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)與其所處的微環(huán)境有關(guān)，因此，通過同步熒光光譜可以考察蛋白質(zhì)所處微環(huán)境的情況[19]。

1.2 紫外-可見吸收光譜法

紫外-可見吸收光譜法技術(shù)簡(jiǎn)便，用于探索蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化和復(fù)合物的形成。蛋白質(zhì)吸收光譜主要有兩個(gè)吸收峰：200 nm 處反映蛋白質(zhì)骨架構(gòu)象，280 nm 處反映芳香族氨基酸，通過關(guān)注這兩個(gè)波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的峰形的變化幫助了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，多酚也會(huì)對(duì)紫外-可見光發(fā)生吸收作用，獲得吸收光譜，從而獲得復(fù)合物的信息[17]。

原花青素B3 和溶菌酶相互作用的研究使用了紫外-可見吸收光譜法，其中原花青素B3 在200 nm有較強(qiáng)的光吸收。與溶菌酶相互作用后，在200 nm處的光吸收強(qiáng)度顯著降低，最大吸收波長(zhǎng)紅移。結(jié)果表明，由于原花青素B3 與溶菌酶的強(qiáng)結(jié)合，肽主鏈的構(gòu)象展開，微環(huán)境的疏水性發(fā)生變化[20]。進(jìn)一步的研究表明，280 nm 處的吸光度略有下降，證實(shí)了原花青素B3 與溶菌酶的相互作用形成了絡(luò)合物[20]。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，利用吸光度的變化探究多酚-蛋白質(zhì)的相互作用具有較高的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。Liu 等[21]發(fā)現(xiàn)在玉米醇溶蛋白-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate,EGCG）體系中，多酚和蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)合后產(chǎn)物的吸光度比它們的混合物的吸光度顯著升高，這一現(xiàn)象被認(rèn)為是共價(jià)復(fù)合物的形成改變了玉米醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)，使得更多酪氨酸和色氨酸殘基暴露在周圍的溶劑中。

1.3 傅里葉變換紅外光譜法

傅里葉變換紅外光譜法用于研究多酚-蛋白質(zhì)相互作用引起的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和氫鍵等的變化，可以為多酚-蛋白質(zhì)相互作用提供動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)變化信息。蛋白質(zhì)酰胺帶的紅外光譜可提供其二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，特征吸收帶主要有酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶，因酰胺Ⅰ帶信號(hào)強(qiáng)而被廣泛使用[22]。酰胺Ⅰ帶主要集中在1600～1700 cm?1，展示了蛋白質(zhì)的α-螺旋（1650～1658 cm?1）、β-折 疊（1610～1640 cm?1）、β-轉(zhuǎn) 角（1660～1695 cm?1）和無規(guī)卷曲（1640～1650 cm?1）等結(jié)構(gòu)信息[23]。用紅外光譜法對(duì)茶多酚與β-乳球蛋白絡(luò)合物的形成進(jìn)行了表征，Kanakis 等[24]并未在酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶發(fā)現(xiàn)明顯的峰紅移或藍(lán)移，但存在峰高度的變化。Jia 等[25]通過酰胺Ⅰ帶峰值擬合觀察綠原酸、阿魏酸和EGCG 分別與β-乳球蛋白的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)這三種多酚誘導(dǎo)蛋白質(zhì)a-螺旋向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，改變了β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 圓二色光譜法

圓二色性是由左右圓偏振光的吸附差異引起的，可以顯示蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。遠(yuǎn)紫外圓二色光譜（≤250 nm）反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量信息，包括α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的含量等。蛋白質(zhì)的近紫外圓二色光譜（>250 nm）提供其三級(jí)結(jié)構(gòu)信息，主要取決于苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸（或S-S 二硫鍵）和色氨酸氨基酸殘基對(duì)偏振光的吸收、偶極取向和周圍環(huán)境的性質(zhì)[26]。圓二色光譜法經(jīng)常與其他方法結(jié)合來研究相互作用，獲得結(jié)合常數(shù)、結(jié)合的化學(xué)計(jì)量數(shù)和其他熱力學(xué)參數(shù)，以及洞察這種相互作用引起的復(fù)合物結(jié)構(gòu)變化[16]。Paul 等[27]使用圓二色光譜觀察β-乳球蛋白與EGCG 結(jié)合前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。遠(yuǎn)紫外圓二色光譜表明，EGCG 與β-乳球蛋白結(jié)合后，使得β-乳球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變。多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的可消化性的改變。β-折疊的增加不利于胃蛋白酶的消化[28]。這可能是茶、咖啡和可可中的多酚提取物延緩β-乳球蛋白消化的原因[29]。

圓二色光譜法和傅里葉變換紅外光譜法都廣泛用于研究蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且方法互補(bǔ)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確描述[30]。二者的區(qū)別在于，圓二色光譜適合預(yù)測(cè)液體樣品的α-螺旋結(jié)構(gòu)，而傅里葉變換紅外光譜法適合分析固體和β-折疊[31]。

1.5 拉曼光譜

拉曼光譜作為一種散射光譜，能夠提供快速、簡(jiǎn)單、可重復(fù)、且無損傷的定性定量分析，用于獲得分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)信息，為物質(zhì)鑒定及結(jié)構(gòu)研究提供補(bǔ)充信息[32]。謝鳳英等[33]使用拉曼光譜測(cè)定蕎麥多酚對(duì)米糠蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)a-螺旋結(jié)構(gòu)含量逐漸降低，β-折疊先增加后降低，β-轉(zhuǎn)角先降低后增加，而無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量逐漸增大的現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)多酚-蛋白質(zhì)的相互作用破壞了米糠蛋白分子間二硫鍵，降低了米糠蛋白分子間作用，增強(qiáng)了米糠蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。然而，拉曼光譜在多酚-蛋白質(zhì)作用研究主要聚焦在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，當(dāng)體系只存在多酚時(shí)，并沒有特征峰的出現(xiàn)。Liu 等[34]對(duì)負(fù)載白藜蘆醇和姜黃素的納米顆粒進(jìn)行拉曼光譜分析，并未觀察到多酚官能團(tuán)特征峰。

成像面前后位置，光柵像平面模糊，其光強(qiáng)分布Id(x,y;di)可由光柵在像平面的光強(qiáng)分布I0x(x,y)與位置di處的系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)h(x,y,di)的卷積得到，表示為

1.6 核磁共振波譜法

核磁共振波譜法通過檢測(cè)分子結(jié)構(gòu)中標(biāo)記的碳元素的化學(xué)位移，直接表明多酚與蛋白質(zhì)是否發(fā)生結(jié)合作用和相關(guān)構(gòu)象的改變[35]。核磁共振光譜法可精確識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)信息，解釋相互作用機(jī)理，分析相互作用構(gòu)效關(guān)系[36]。Faurie 等[37]使用EGCG 滴定，并保持在滴定過程中唾液肽濃度恒定，獲得了蛋白質(zhì)質(zhì)子化學(xué)轉(zhuǎn)移的信息，從而得到關(guān)于結(jié)合位點(diǎn)和聚合體類型的信息。Silva 等[38]利用核磁共振光譜法研究單寧和唾液蛋白之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)相互作用與單寧結(jié)構(gòu)及疏水性有關(guān)；此外，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中某些特定氨基酸，如脯氨酸，起到穩(wěn)定疏水性堆疊的作用，也會(huì)影響單寧與唾液蛋白的相互作用。

1.7 顯微鏡觀察法

關(guān)于多酚-蛋白質(zhì)相互作用的顯微觀察方法，主要有原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡以及激光共聚焦顯微鏡，這些顯微鏡觀察法為直接觀察多酚-蛋白質(zhì)相互作用提供支持，對(duì)樣品適應(yīng)性較強(qiáng)，利于結(jié)構(gòu)解析。

原子力顯微鏡是在掃描隧道顯微鏡的基礎(chǔ)上研制而成的一種掃描探針顯微鏡，通過探針與被測(cè)樣品之間的微相互作用（原子力）獲得物質(zhì)超微結(jié)構(gòu)及表面信息，進(jìn)而對(duì)樣品表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，常用于研究分子間的相互作用，如表征多酚與蛋白質(zhì)間的相互作用[39]。該方法能提供三維表面圖，具有樣品制備簡(jiǎn)單、無需覆蓋導(dǎo)電薄膜、成像分辨率高的特點(diǎn)，但是也存在一定的缺陷，如成像范圍小、速度慢、受探頭影響較大等[40]。Liu 等[41]使用原子力顯微鏡觀察90 ℃的熱處理前后，綠原酸和EGCG 分別與乳鐵蛋白的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)這兩種多酚均可以抵抗加熱造成的乳鐵蛋白聚集，其中，綠原酸的作用更為明顯，這一結(jié)果為擴(kuò)大乳鐵蛋白在食品中的應(yīng)用提供可能。上述結(jié)果表明，原子力顯微鏡是一種有效的跟蹤蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象的方法。

掃描電子顯微鏡通過電子束射到樣品表面產(chǎn)生次級(jí)電子，次級(jí)電子富集后轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，從而得到樣品表面結(jié)構(gòu)的立體掃描圖像、微觀形貌放大像、表面組成分布、晶體的晶向和晶格常數(shù)、發(fā)光性試樣的結(jié)構(gòu)缺陷等，該方法樣品制備容易，耗時(shí)少，可做綜合分析，放大倍數(shù)范圍廣，場(chǎng)深大，但是，掃描電子顯微鏡的分辨率有限，為6～10 nm，不利于較小分子的觀察[42]。Liu 等[21]使用掃描電子顯微鏡，對(duì)六羥黃酮、綠原酸、EGCG 三種多酚與玉米醇溶蛋白結(jié)合后的形態(tài)進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)三種多酚誘導(dǎo)玉米醇溶蛋白分子的自組裝，并推測(cè)多酚改變了多酚和蛋白質(zhì)之間的吸引和排斥作用的大小和范圍，尤其是疏水和靜電相互作用。

激光掃描共聚焦顯微鏡通過共焦光學(xué)消除不需要的焦點(diǎn)外散射光，增強(qiáng)樣品的焦點(diǎn)內(nèi)區(qū)域的對(duì)比度，可對(duì)固定的組織或活體樣本進(jìn)行亞細(xì)胞水平結(jié)構(gòu)的觀測(cè)，能夠3D 成像，但是，分辨率比掃描電子顯微鏡低，成本更高[43]。Diaz 等[44]使用激光掃描共聚焦顯微鏡，觀察發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓汁和紅莓汁中的多酚與蛋白質(zhì)作用形成的顆粒均較小，且形狀規(guī)則，結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為藍(lán)莓汁多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合的顆粒可以穩(wěn)定食物功能性成分。Zou 等[45]制備了一種新型玉米醇溶蛋白/單寧酸復(fù)合膠體顆粒，依靠激光掃描共聚焦顯微鏡直觀地觀察到油滴被致密的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)包圍。

1.8 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜是一種檢測(cè)和鑒定未知分子的方法，這些未知分子的范圍從小分子到納米顆粒。質(zhì)譜在研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，不是對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行檢測(cè)，而是對(duì)小分子蛋白質(zhì)復(fù)合物被電離后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，用于確定小分子蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)，是一種靈敏、快速、樣品消耗低、易于自動(dòng)化，可用于高通量的方法[46]。Gallo 等[47]使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析巧克力多酚與α-乳白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，確定結(jié)合位點(diǎn)為半胱氨酸的游離硫醇基團(tuán)，這是首次關(guān)于食品多酚與牛奶蛋白共價(jià)加和位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)研究。

質(zhì)譜技術(shù)作為一種高通量的測(cè)量手段，在研究多酚-蛋白質(zhì)相互作用方面具有巨大的潛力。全自動(dòng)nano-ESI-MS 方法主要用于在短時(shí)間內(nèi)篩選數(shù)百種潛在候選藥物[48]。此外，親和柱與質(zhì)譜耦合方法有助于找到新的核受體配體[49]。這類技術(shù)在研究多酚-蛋白質(zhì)相互作用方面也表現(xiàn)出較大的潛力。

2 多酚-蛋白質(zhì)相互作用的間接分析方式

2.1 等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法通過計(jì)算多酚與蛋白質(zhì)反應(yīng)中的反應(yīng)熱，得到過程中的熱力學(xué)參數(shù)[16]。該方法具有如下特點(diǎn)：等溫滴定量熱法的信息在均勻相中產(chǎn)生，沒有標(biāo)注，保證了方法的準(zhǔn)確性；目標(biāo)物質(zhì)量不影響信號(hào)強(qiáng)度，這對(duì)于小分子十分有利；缺點(diǎn)在于分析時(shí)間長(zhǎng)，自動(dòng)化或高通量篩選能力有限，樣品量大[16]。王寧[50]使用等溫滴定量熱法，計(jì)算得到了反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)，相互作用的化學(xué)計(jì)量學(xué)、親和力常數(shù)、焓變化、熵變化、吉布斯自由能和恒壓摩爾熱容；通過這些數(shù)據(jù)推測(cè)綠原酸與三種蛋白的結(jié)合是自發(fā)進(jìn)行的，結(jié)合過程受到熵驅(qū)動(dòng)；計(jì)算反應(yīng)前后自由能變化的大小，確定人血清蛋白與綠原酸的結(jié)合能力最強(qiáng)，結(jié)合力大小順序?yàn)槿搜宓鞍?胰蛋白酶>胃蛋白酶。此外，等溫滴定量熱法常與其他技術(shù)結(jié)合來研究小分子與蛋白質(zhì)的相互作用，如茶兒茶素作為過氧化氫酶的抑制劑的可能機(jī)制[51]。

2.2 差示掃描量熱法

2.3 散射法

散射法是一類適用于研究多酚與蛋白質(zhì)聚集作用的方法，主要包括小角度散射、濁度法以及動(dòng)態(tài)光散射法。小角度散射是生物大分子、納米復(fù)合材料、合金和合成聚合物結(jié)構(gòu)分析的基本方法[56]。小角度散射包括小角度X 射線散射（Small-angle X-ray scattering,SAXS）和小角度中子散射（Small-angle neutron scattering,SNAS），結(jié)構(gòu)信息的響應(yīng)隨著添加配體或結(jié)合物，以及溶劑的物理和/或化學(xué)特性而改變，可以提供分子間折疊和組裝過程的動(dòng)力學(xué)信息[57]。澀味是紅酒等飲品中最重要的感官品質(zhì)之一，是單寧和唾液中富含脯氨酸的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用產(chǎn)生的。在水溶液和膠體水平上，Canon 等[58]使用小角度X 射線散射對(duì)黃烷-3-醇和富含脯氨酸蛋白之間的相互作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了聚集物具有核狀結(jié)構(gòu)。

濁度法（Nephelometry）通過測(cè)量一束光通過含有懸浮顆粒的溶液時(shí)，產(chǎn)生的散射光來研究多酚與蛋白質(zhì)的聚集物[59]。多酚含量與濁度值有直接關(guān)系，然而，濁度法的測(cè)量受到幾個(gè)因素的影響。主要是聚集物的尺寸，該方法要求所有的顆粒應(yīng)該是較小且?guī)缀跸嗤某叽?。因此，為避免形成較大的團(tuán)聚體，濁度法測(cè)定應(yīng)在較短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行[60]。

動(dòng)態(tài)光散射法（Dynamic light scattering,DLS）可以幫助解決濁度法中遇到的問題，是一種實(shí)時(shí)、快速、無損的統(tǒng)計(jì)學(xué)顆粒粒徑測(cè)量方法，并且相對(duì)于電鏡法可以對(duì)樣品進(jìn)行原位觀測(cè)[61]。Mcrae 等[62]使用動(dòng)態(tài)光散射觀察，發(fā)現(xiàn)加入B 型-原花青素三聚體后，觀察到蛋白質(zhì)聚集物生成，并且隨著原B 型-原花青素三聚體的進(jìn)一步增加，聚集物的粒徑緩慢增加，說明B 型-原花青素三聚體與蛋白質(zhì)形成了復(fù)合物。

2.4 X 射線衍射法

X 射線衍射是測(cè)定分子結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可用于解析從幾個(gè)道爾頓到理論上不受限制的分子量的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并可用于解析包含不同配合物的分子[63]。X 射線衍射使用X 射線照射源來產(chǎn)生光束（也可以使用電子或中子）被目標(biāo)樣本衍射，得到的衍射圖樣可以用來重建樣品的三維結(jié)構(gòu)。此方法對(duì)樣品要求高，但是要求樣品處于結(jié)晶狀態(tài)[16]。夏雨等[64]使用X 射線衍射法研究不同濃度茶多酚對(duì)明膠的改性作用，發(fā)現(xiàn)不同濃度茶多酚與明膠交聯(lián)后蛋白質(zhì)的結(jié)晶面距離均變小，其中，2 g/L 的茶多酚與明膠交聯(lián)后蛋白質(zhì)結(jié)晶面的距離最短，即2 g/L 的茶多酚對(duì)明膠的交聯(lián)作用最強(qiáng)。

2.5 生物傳感器

國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）定義生物傳感器是一類將生化信息轉(zhuǎn)換為分析信號(hào)的裝置[65]。生物傳感器（Biosensor）根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)不同分為電化學(xué)傳感器、光學(xué)傳感器、聲學(xué)傳感器和量熱傳感器（參考2.1 等溫滴定量熱法）。各類傳感器通常需要一個(gè)存在相互作用的物質(zhì)，被固定在表面上，用以創(chuàng)造傳感元件，這一物質(zhì)可以是小分子，也可以是蛋白質(zhì)。雖然所有這些基于傳感器的技術(shù)只需要少量的蛋白質(zhì)被固定，但根據(jù)小分子-蛋白質(zhì)相互作用的親和力，需要的小分子數(shù)量可能非常高[66]。

電化學(xué)傳感器（Electrochemical transduction sensors）設(shè)備簡(jiǎn)單，信號(hào)強(qiáng)度不依賴分子大小，包括安培、電位和阻抗傳感器[66]。目前關(guān)于電化學(xué)的研究中，大多利用分子間相互作用測(cè)定目標(biāo)物含量。Datta等[67]利用酪氨酸酶和金納米粒子修飾的生物膜，使用電化學(xué)傳感器檢測(cè)茶葉和葡萄酒中的多酚含量，線性良好。

光傳感器（Optical sensors）中，表面等離子共振生物傳感器具有免標(biāo)記、高靈敏度、實(shí)時(shí)定量的特點(diǎn)，可以同時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)多個(gè)生物分子間的相互作用[68]。當(dāng)生物分子在表面發(fā)生相互作用后，導(dǎo)致敏感層介電常數(shù)和折射率變化，使得傳感器電磁場(chǎng)變化，最終反映到光電信號(hào)的變化上。Guerreiro 等[69]利用超薄的智能分子印跡聚合物捕獲和穩(wěn)定在等離子體傳感器表面的復(fù)雜蛋白基質(zhì)，研究了兒茶素、B 型-原花青素二聚體與唾液蛋白的相互作用，該技術(shù)為研究食品中小分子生物利用度提供可能。

在聲傳感器（Acoustic）中會(huì)用到電聲裝置，其工作原理是檢測(cè)由化學(xué)交互材料與壓電材料接觸而制成的薄膜的質(zhì)量密度、彈性、粘彈性、電或介電特性的變化。其中，石英晶體微平衡傳感器通過測(cè)量石英晶體諧振器的頻率變化來測(cè)量單位面積的質(zhì)量。Naoto 等[70]使用石英晶體微平衡來研究小分子與固定蛋白的結(jié)合，顯示兒茶素與肌鈣蛋白C（心力衰竭的標(biāo)志）具有較高的親和力。

2.6 界面擴(kuò)張流變學(xué)性質(zhì)的測(cè)量方法

界面擴(kuò)張流變學(xué)性質(zhì)能夠反映不同分子在界面層上的吸附和分散行為，對(duì)于研究復(fù)合體系中各組分間的相互作用具有重要意義，該方法通過比較界面粘彈特性、弛豫過程、界面張力等特征參數(shù)，建立適合于分析不同類型組分的理論模型，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性良好等特點(diǎn)，能夠直觀地反映出相互作用對(duì)加工性能的影響[3]。

Rossetti 等[71]將界面擴(kuò)張流變學(xué)性質(zhì)應(yīng)用于茶多酚與唾液蛋白的相互作用中，發(fā)現(xiàn)兩者間的相互作用隨著多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)和酚環(huán)的數(shù)量發(fā)生改變，該研究為揭示食品在口腔中收斂、苦澀等風(fēng)味的形成機(jī)制提供參考。Zou 等[72]利用單寧與玉米蛋白顆粒在空氣-水界面的顆粒相互作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)玉米蛋白顆粒由于吸附速度快、顆粒間作用力大，導(dǎo)致在界面處覆蓋面積小，形成了較大的團(tuán)聚體，單寧的氫鍵削弱了顆粒的疏水性，從而削弱了流體界面的顆粒間力，可以降低玉米蛋白顆粒在界面上的吸附和組裝速率，這也為玉米蛋白顆粒重新排列成有序的界面網(wǎng)絡(luò)提供了足夠的時(shí)間。

2.7 分子對(duì)接

分子對(duì)接（Molecular docking,MD）是一種通過硅計(jì)算工具計(jì)算，模擬分子間相互識(shí)別的方法，可確定配體與靶結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合構(gòu)象和結(jié)合的最佳位置、方向，補(bǔ)充了多酚和蛋白質(zhì)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[73]。分子對(duì)接方法允許從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中可用的結(jié)構(gòu)中選擇不同的蛋白質(zhì)目標(biāo)進(jìn)行大規(guī)模篩選，具體的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫參考魏冬青等[74]的文章。分子對(duì)接根據(jù)分子構(gòu)象是否可以改變分為三類，即柔性對(duì)接、半柔性對(duì)接和剛性對(duì)接：柔性對(duì)接一般用于精確考慮分子間識(shí)別情況，計(jì)算耗費(fèi)最大；半柔性對(duì)接常用于處理大分子和小分子間的對(duì)接，一般小分子構(gòu)象可變，而大分子構(gòu)象不可變；剛性對(duì)接適合大分子和大分子之間的對(duì)接[75]。為了使每個(gè)多酚都能獨(dú)立于每個(gè)蛋白質(zhì)已知的配體結(jié)合位點(diǎn)，找到可能的其他結(jié)合位點(diǎn)，可以采用盲對(duì)接的方法。在研究蘋果多酚和蛋白質(zhì)相互作用中，Scafuri 等[76]就使用了盲對(duì)接的方法，確定了具有最低結(jié)合能的蘋果多酚-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

2.8 分子動(dòng)態(tài)模擬

分子動(dòng)態(tài)模擬（Molecular simulation docking,MSD）是在原子水平上獲取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，具有瞬時(shí)清晰度，能夠得到構(gòu)象變化、配體結(jié)合以及蛋白質(zhì)折疊的信息等[77]，用于預(yù)測(cè)干擾（突變、磷酸化、質(zhì)子化或配體的添加或去除）對(duì)生物分子的影響，但是，在模擬過程中共價(jià)鍵不會(huì)形成和斷裂使得方法具有局限性[78]。Abdulatif 等[8]使用分子對(duì)接和分子動(dòng)態(tài)模擬方法對(duì)蘆丁與β-乳球蛋白結(jié)合進(jìn)行研究。分子對(duì)接結(jié)果表明，蘆丁與β-乳球蛋白有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并且兩個(gè)位點(diǎn)均依靠氫鍵和疏水相互作用。在位點(diǎn)1 處，有6 個(gè)氨基酸殘基參與氫鍵作用，13 個(gè)氨基酸殘基參與疏水相互作用；在位點(diǎn)2 處，有7 個(gè)氨基酸殘基參與氫鍵作用，3 個(gè)氨基酸參與疏水相互作用。分子動(dòng)態(tài)模擬結(jié)果表明，蘆丁與β-乳球蛋白在位點(diǎn)1 處形成了更為穩(wěn)定的復(fù)合物，因此，推斷蘆丁與β-乳球蛋白主要在位點(diǎn)1 處結(jié)合。

3 結(jié)語與展望

目前來看，無論是直接分析方式還是間接分析方式，均存在一定的局限性。直接分析方式中，掃描電子顯微鏡[79]和激光掃描共聚焦顯微鏡[43]分辨率不夠高，不利于較小分子的觀察，而原子力顯微鏡分辨率較高，但是成像范圍小、速度慢、受探頭影響較大[40]；質(zhì)譜技術(shù)研究多酚-蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物，存在電離過程破壞多酚-蛋白質(zhì)之間的相互作用（疏水作用）[16]、分析中峰展寬和離子抑制[80]及小分子質(zhì)量變化被弱化從而影響復(fù)合物分析的問題[81]。間接分析方式中，界面擴(kuò)張流變學(xué)性質(zhì)測(cè)量方法需要可供食品組分發(fā)生吸附或擴(kuò)散作用的界面層，但食品基質(zhì)的復(fù)雜性決定了并不是每種組分都會(huì)在這兩個(gè)界面上表現(xiàn)出吸附行為[3]。

而針對(duì)食品真實(shí)體系中多酚-蛋白相互作用的研究具有重要的食品加工學(xué)意義。一方面，多酚-蛋白質(zhì)的相互作用對(duì)食品品質(zhì)有積極作用：如多酚可通過與蛋白質(zhì)交聯(lián)提高啤酒泡沫穩(wěn)定性[82]；奶茶中的牛奶蛋白可提高茶多酚的抗氧化能力[83]等。另一方面，多酚-蛋白質(zhì)相互作用對(duì)食品品質(zhì)有不利影響：如研究發(fā)現(xiàn)巧克力中的多酚與牛奶蛋白結(jié)合并發(fā)生作用后，降低巧克力多酚的消化吸收以及抗氧化活性[84]；油菜籽多酚常與油菜籽蛋白結(jié)合，導(dǎo)致油菜籽蛋白提取物色澤變暗，產(chǎn)生異味，感官品質(zhì)嚴(yán)重下降[85]。大量的前期探索研究主要還在模擬及推演體系中進(jìn)行，而真實(shí)體系中多酚-蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)制尚未完全明確，并且由于此類相互作用極易受到食品加工條件的影響，探究加工環(huán)境對(duì)相互作用的影響具有較大的實(shí)際意義。因此，食品復(fù)雜體系相互作用的研究對(duì)分析方法的準(zhǔn)確性和特異性提出了更高的要求，考慮到食品加工環(huán)境的變化，原位檢測(cè)分析技術(shù)亟待突破。