程 峰，劉 宇，楊 珍，莫亞男，尚若鋒，郝寶成，王學(xué)紅，梁劍平

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730050）

由于在人類疾病治療中抗生素的不合理使用，細(xì)菌耐藥性問題變得越來越嚴(yán)重，特別是耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）的大流行，更是引起了人們對(duì)細(xì)菌耐藥性問題的廣泛關(guān)注[1]。MRSA 可以引起多種疾病，例如醫(yī)院獲得性感染、社區(qū)獲得性感染、肺炎、敗血癥和皮膚感染[2]。MRSA 還特別容易形成由生物被膜（biofilm，BF），生物被膜是指細(xì)菌黏附于接觸表面所形成的大量細(xì)菌聚集膜狀物[3]，是細(xì)菌為了適應(yīng)自然環(huán)境有利于生存的一種特殊結(jié)構(gòu)。研究表明，生物被膜形成后細(xì)菌的數(shù)量會(huì)顯著增加，并且可以逃避免疫系統(tǒng)的識(shí)別[4]。同時(shí)，生物被膜可以顯著增加細(xì)菌對(duì)藥物的抵抗能力，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性問題愈發(fā)嚴(yán)重，有研究表明游離細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性是生物膜態(tài)細(xì)菌的10～1000 倍左右[5?6]。但是在臨床上只有很少的藥物對(duì)MRSA 生物被膜有很好的抑制或者清除作用[7?8]。因此開發(fā)一種新的可以有效控制MRSA 生物被膜的藥物迫在眉睫。

茶樹精油（tea tree oil，TTO）是從澳大利亞的桃金娘科互葉白千層的新鮮枝葉中以水蒸汽蒸餾的方式提取出來的一種無色至淡黃色液體，有尖銳的樟腦氣味和薄荷醇的清涼感[9]。茶樹精油具有廣譜抗細(xì)菌[10]、真菌[11]、病毒[12]以及寄生蟲[13]等生物活性，因而在香料、農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)以及化妝品等行業(yè)都具有廣泛的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，茶樹精油對(duì)金黃色葡萄球菌[10]和白色念珠菌[14]等多種細(xì)菌和真菌生物被膜的形成也有一定的抑制作用，可以破壞它們的生物被膜，但其機(jī)制尚不完全明確。因此本文選取MRSA的標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43300 作為實(shí)驗(yàn)菌株，來研究茶樹精油對(duì)于MRSA 生物被膜的抑制機(jī)制，為茶樹精油作為新型抗菌天然藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MRSA 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43300 美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種庫；茶樹精油 澳大利亞Maincamp 公司；BHI 培養(yǎng)基、TSB 培養(yǎng)基 英國(guó)Oxoid（Fisher）公司；MHA/B培養(yǎng)基 北京奧博星公司；RNA 提取試劑盒 杭州博日生物科技公司；q-RT-PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 日本Takara 公司；LIVE/DEAD? BacLight?試劑盒 美國(guó)ThermoFisher Scientific公司。

多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)GENE 公司；激光共聚焦顯微鏡 德國(guó)ZEISS 公司；超微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Plextech 公司；熒光定量PCR 儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶樹精油對(duì)MRSA 懸浮細(xì)菌的抑制作用 根據(jù)CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）藥敏實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)，使用微量稀釋法測(cè)定了茶樹精油對(duì)1 株標(biāo)準(zhǔn)菌株（MRSA，ATCC43300）以及12 株臨床分離菌株（金黃色葡萄球菌）的最小抑菌濃度（MIC）以及最小殺菌濃度（MBC）。MIC 指能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度，MBC 指能殺滅99.9%的細(xì)菌的最小藥物濃度。

1.2.2 茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜形成的抑制作用參照Srdjan 等[15]的方法培養(yǎng)生物被膜并進(jìn)行染色。首先在TSB 培養(yǎng)中將MRSA 靜置培養(yǎng)24 h 以活化MRSA，然后將活化好的MRSA 用TSB-g（添加了1%葡萄糖的TSB 培養(yǎng)基）培養(yǎng)基稀釋100 倍，同不同濃度的茶樹精油（使茶樹精油的終濃度為0.64%、0.32%、0.16%、0.08%、0.04%和0）一起加到平底的96 孔板中，靜置培養(yǎng)，在6、12、24、36、48 h時(shí)棄去培養(yǎng)基，用無菌PBS 清洗3 遍，加入10%的甲醛固定過夜，棄去甲醛晾干，加入0.1%的結(jié)晶紫溶液染色30 min 后棄去結(jié)晶紫，然后用流水沖洗干凈殘余的結(jié)晶紫，至烘箱中烘干，加入95%的乙醇重懸結(jié)晶紫，靜置30 min 后在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD590。

1.2.3 茶樹精油對(duì)成熟生物被膜的清除作用 參照Srdjan 等[15]的方法制備成熟的生物被膜，制備好成熟的生物被膜之后，棄去培養(yǎng)基，用無菌PBS 清洗2～3 次，然后加入用TSB-g 培養(yǎng)基稀釋好的茶樹精油，使茶樹精油的濃度分別為0.16%、0.08%、0.04%、0.02%、0.01%和0。在24 h 時(shí)棄去培養(yǎng)基，用無菌PBS 清洗3 遍，加入10%甲醛固定過夜，棄去甲醛，加入結(jié)晶紫染色后用流水沖洗干凈，加入95%乙醇重懸結(jié)晶紫，靜置30 min 后測(cè)定OD590，然后計(jì)算不同濃度的茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜的清除率，計(jì)算公式為清除率（%）=（OD0?OD1）×100/OD0，式中，OD0為茶樹精油濃度為0 時(shí)測(cè)得的吸光度，OD1為使用不同茶樹精油濃度作用后生物被膜后所測(cè)得的吸光度。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜的影響 在6 孔板中使用細(xì)胞爬片培養(yǎng)生物被膜，并且加入不同濃度的茶樹精油并使茶樹精油的濃度分別為0.16%、0.08%、0.04%和0。使用賽默飛LIVE/DEAD? BacLight?試劑盒進(jìn)行染色，然后使用蔡司LSM800 激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照，熒光選擇FITC 和Texas Red，用ZEN 2.3 軟件進(jìn)行圖像處理。

1.2.5 茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜形成過程中多糖黏附素（PIA）合成和胞外（eDNA）釋放的影響 參照官妍等[16]的方法，將用TSB 培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)活化后的MRSA 接種在含有不同濃度茶樹精油（0.08%、0.04%、0.02%和0）的剛果紅平板上。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h 觀察平板變黑的程度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。eDNA 的提取參照Kelly 等[17]的方法，將用TSB 培養(yǎng)基活化后的MRSA 用TSB-g 培養(yǎng)基稀釋后加到24 孔板中，然后加入不同濃度的茶樹精油并使茶樹精油的濃度分別為0.16%、0.08%、0.04%、0.02%和0。靜置培養(yǎng)24 h，加入10 μL 的EDTA，置4 ℃冰箱靜置1 h，棄去培養(yǎng)基，加入700 μL 的TEN 緩沖液混勻，測(cè)定OD600并記錄，然后將菌懸液移至新的EP 管中，12000 r/min 離心后將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，用苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）和氯仿/異戊醇（24:1）分別萃取一次，將上層水相加入3 倍體積的100%乙醇與1/10 體積的乙酸鈉中，?20 ℃冰箱過夜后18000×g 離心20 min，棄去上清并加入預(yù)冷的70%乙醇洗滌，風(fēng)干，并溶于20 μL TE 中，用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度。eDNA 的相對(duì)表達(dá)量用單位生物被膜的eDNA 含量來表示。

1.2.6 茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜形成相關(guān)基因的影響 MRSA 細(xì)菌生物被膜形成有多種相關(guān)的基因，采用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)MRSA 生物被膜形成基因cidA，agrA的上下游引物（表1）。將含有0.08%茶樹精油的菌懸液（使用TSB-g 培養(yǎng)基）在6 孔板中靜置培養(yǎng)24 h，使用Simply P Total RNA Extraction Kit （Bioflux）試劑盒提取其總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證提取RNA 的完整性；使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的濃度，使用Taraka 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最后使用Taraka 熒光定量試劑盒進(jìn)行q-RT-PCR 擴(kuò)增，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

表1 PCR 引物Table 1 PCR primer

PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，DNase/RNase-Free Water 6 μL，上、下游引物（10 μmoL/L）各0.8 μL，ROX 0.4 μL，DNA 模板2 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃60 s；95 ℃ 15 s。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE）的形式表示。使用SPSS 23.0 進(jìn)行t檢驗(yàn)確定所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)差異，P<0.05的值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹精油對(duì)懸浮菌的抑制作用

茶樹精油對(duì)懸浮菌具有良好的抗菌效果，本研究測(cè)定了茶樹精油對(duì)MRSA 以及12 株臨床分離得到的金黃色葡萄球菌的MIC 值與MBC 值，如表2所示，茶樹精油對(duì)13 株金黃色葡萄球菌的MIC 值在0.08%～0.32%之間，MBC 值在0.16%～0.32%之間。當(dāng)一個(gè)藥物對(duì)細(xì)菌的MBC/MIC≤4 時(shí)被認(rèn)為是殺菌劑[18]。對(duì)于本研究中的大多數(shù)菌株來說，茶樹精油對(duì)其的MBC 值是MIC 值的2 倍，因此，茶樹精油對(duì)本研究中的細(xì)菌具有殺菌作用。

表2 茶樹精油對(duì)金黃葡萄球菌的MIC 值Table 2 MIC of tea tree oil against Staphylococcus aureus

2.2 茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜的影響

如圖1所示，0.64%和0.32%濃度的茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜形成的抑制效果最明顯，基本沒有形成生物被膜；0.16%的茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜形成的抑制也有顯著效果，在24 和48 h 時(shí)的抑制率分別達(dá)到65.74%±0.97%（P<0.01）和51.35%±2.13%（P<0.01）；0.04%和0.02%的茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜的形成也有一定的抑制效果，24 h 時(shí)抑制率分別達(dá)到53.44%±0.47%（P<0.01）和41.96%±1.81%（P<0.05）。從圖1中可以看出，茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜的形成有較強(qiáng)的抑制效果，并呈現(xiàn)濃度依賴性。

圖1 茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜生長(zhǎng)的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of tea essential oil on MRSA biofilm growth

2.3 茶樹精油對(duì)MRSA 成熟生物被膜的清除作用

如圖2所示，茶樹精油對(duì)MRSA 成熟的生物被膜具有極顯著的清除作用（P<0.01），與對(duì)照組相比，0.02%的茶樹精油即可對(duì)MRSA 的生物被膜產(chǎn)生一定的清除作用，隨著濃度的增高，清除率也逐漸增高，當(dāng)茶樹精油濃度達(dá)到0.16%時(shí)，清除率達(dá)到92.55%±1.15%，接近100%。如圖3所示，激光共聚焦顯微鏡照片也顯示出了茶樹精油對(duì)MRSA 成熟生物被膜的強(qiáng)大的清除作用，隨著茶樹精油濃度的升高，活細(xì)菌逐漸減少，死細(xì)菌逐漸增多，生物被膜逐漸稀疏。通常，去除成熟的生物被膜比抑制其形成更加困難。因此，茶樹精油可以被認(rèn)為是一種潛在的抗生物被膜劑，因?yàn)樗粌H可以抑制生物被膜的形成，而且可以破壞成熟的生物被膜。所以有必要進(jìn)一步研究茶樹精油的抗生物被膜活性并闡明其作用機(jī)理。

圖2 茶樹精油對(duì)MRSA 成熟生物被膜的清除作用Fig.2 Clearance of tea tree oil against MRSA mature biofilm

圖3 激光共聚焦顯微鏡細(xì)下MRSA 生物被膜圖像Fig.3 CLSM image of LIVE/DEAD stained MRSA biofilms grown on cell slide

2.4 茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜影響的初步機(jī)制探究

PIA 對(duì)于生物被膜形成的黏附階段和聚集階段具有重要的意義[19]。PIA 與剛果紅特異性反應(yīng)變黑，根據(jù)平板變黑的程度可以判斷PIA 產(chǎn)生量的多少。由圖4可知，隨著藥物濃度的增加，黑色逐漸變淺，表明PIA 的合成量逐漸減少，說明茶樹精油可以抑制MRSA 生物被膜中PIA 的合成。

圖4 茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜中PIA 的影響Fig.4 Effect of tea tree oil on PIA in MRSA biofilm

eDNA 是細(xì)菌在形成生物被膜過程中部分細(xì)菌裂解釋放的生物被膜基質(zhì)（EPS）重要組成成分[20]，在生物膜形成的各個(gè)階段都起著至關(guān)重要的作用，包括初始細(xì)菌粘附、聚集、微菌落形成以及生物膜結(jié)構(gòu)的確認(rèn)[21]。如圖5所示，茶樹精油即可對(duì)MRSA 生物被膜形成過程eDNA 的釋放有一定的抑制效果，在茶樹精油濃度為0.16%時(shí)，eDNA 的含量減少了91.25%±2.46%（P<0.01）。并且抑制效果呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著茶樹精油濃度的增加，抑制效果也變得更加明顯。eDNA 以及PIA 含量的降低說明細(xì)菌之間的黏附能力下降，導(dǎo)致其生物被膜的完整性被破壞，表現(xiàn)出抗生物被膜活性。因此，茶樹精油可能通過eDNA 的釋放以及PIA 的合成抑制MRSA 生物被膜的形成。

圖5 茶樹精油對(duì)eDNA 分泌的影響Fig.5 Influence of tea tree oil effect on the secretion of eDNA

生物被膜形成過程中關(guān)鍵的調(diào)控基因有agr、ica、cid、sar等。agr主要調(diào)控細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，有研究證明agr是細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)（QS）的主要調(diào)控分子，對(duì)生物被膜的成熟階段至關(guān)重要[22]。ica基因主要調(diào)控PIA 的合成，同時(shí)也可以調(diào)節(jié)細(xì)菌之間的黏附和聚集[23]。cid主要調(diào)控細(xì)菌的程序性死亡與溶解，可以間接地參與調(diào)控eDNA 的釋放[24]。sarA是金黃色葡萄球菌的全局調(diào)控因子，主要調(diào)控金黃色葡萄球菌毒力基因的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)；sarA可以和ica操縱子的啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)ica的表達(dá)，進(jìn)而影響PIA 的合成[25]。采用熒光定量PCR 對(duì)茶樹精油對(duì)MRSA 生物被膜形成過程中這些基因的表達(dá)的影響進(jìn)行研究，使用2?ΔΔt對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量，熒光定量PCR 結(jié)果如表3所示。茶樹精油作用后的MRSA 細(xì)胞內(nèi)agrA、cidA、sarA、icaA等基因的表達(dá)水平均下調(diào)，茶樹精油對(duì)以上4 種基因的表達(dá)均有顯著的抑制作用，因此，茶樹精油可能通過抑制agrA、icaA、cidA 及sarA等基因的表達(dá)從而抑制的MRSA 生物被膜中eDNA 的釋放以及PIA 的合成，進(jìn)一步表現(xiàn)出抗MRSA 生物被膜活性。

表3 茶樹精油作用后MRSA 部分基因表達(dá)量的變化Table 3 Changes in the expression of some genes in MRSA treatment by tea tree essential oil

3 結(jié)論

綜上所述，茶樹精油可以有效殺滅MRSA 的懸浮菌，并具有強(qiáng)大的抗生物被膜作用，結(jié)晶紫半定量和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)說明茶樹精油不僅可以抑制生物被膜的形成，也可以有效地清除成熟的生物被膜。其可能的機(jī)理是茶樹精油通過抑制agrA、icaA、cidA及sarA4 種基因的表達(dá)，從而抑制MRSA 細(xì)菌生物被膜形成過程中eDNA 的釋放以及PIA 的合成，由此降低生物被膜的粘附性，表現(xiàn)出抗生物被膜活性。同時(shí)，茶樹精油本身也是一種良好的殺菌劑，對(duì)脫離了生物被膜的MRSA 細(xì)菌也具有強(qiáng)大的殺滅作用。而關(guān)于茶樹精油如何抑制生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)仍需要進(jìn)一步的深入研究。