孫 偉， 匡 科， 嚴(yán) 興， 李碧清， 雷 芳， 王 雙， 肖先念

廣州市凈水有限公司， 廣東 廣州 510163

污泥資源化是目前城市污泥處理方式中應(yīng)用較為廣泛的一種方式[1]. 污泥堆肥致力于N、P、K等營養(yǎng)元素的保留以及有機(jī)質(zhì)的穩(wěn)定和腐熟，從而制備高肥效、低毒性的土壤改良劑[2]. 但污泥中也不可避免地含有病原菌、臭氣和難降解有機(jī)物等有害物質(zhì)，特別是生化工藝不能完全降解的合成洗滌劑、化妝品等難降解有機(jī)物在污泥中大量富集，我國各地區(qū)城市污泥中PAHs總量都超過10 mg/kg，其中廣州市城市污泥中PAHs總量的平均值為33.1 mg/kg，二次污染風(fēng)險(xiǎn)較大[3-5]，研究證明，堆肥處理產(chǎn)生的高溫高熱可有效地殺滅其中病原菌和寄生蟲卵[6]，但不能完全去除污泥中的難降解有機(jī)物[7-8]. 難降解有機(jī)物分子量較大、沸點(diǎn)高、不易揮發(fā)，污染風(fēng)險(xiǎn)較大，且降解除去困難，易在土壤和農(nóng)作物體內(nèi)積累[9-10]. 隨著抗生素的廣泛使用，活性污泥已成為抗生素和抗性基因的重要富集位點(diǎn)，其未經(jīng)處理直接施用具有潛在的生態(tài)環(huán)境和人類健康風(fēng)險(xiǎn)[11-12]. 污泥堆肥可以消減城市污泥中的抗生素，并對抗性基因的傳播和擴(kuò)散具有一定的控制效果[13-14].

目前對污泥堆肥中難降解有機(jī)污染物的研究尚處于摸索階段，研究也有待進(jìn)一步深入，堆肥產(chǎn)品的土地利用還沒有完整的科學(xué)理論依據(jù)[15-16]. 污泥堆肥后必然會(huì)有抗生素和抗性基因的殘留[17-19]，其在施用于土壤過程中，殘留的抗生素是否會(huì)對土壤活性、微生物群落結(jié)構(gòu)造成影響？殘留的抗生素抗性基因是否會(huì)發(fā)生水平遷移？這些都是污泥堆肥土地利用過程中亟需解決的問題. 因此，該研究通過污泥混合木屑、微生物發(fā)酵菌、生物質(zhì)炭和蘑菇渣進(jìn)行共堆肥研究，探討難降解有機(jī)物的降解去除以及抗生素和抗性基因的消解情況等，并進(jìn)行了土壤改良試驗(yàn)，以期為堆肥產(chǎn)品的應(yīng)用提供有效的技術(shù)和理論支持.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)裝置

城市污泥取自廣州市大坦沙污水處理廠，屬于典型的城市污水處理廠剩余污泥，從離心脫水機(jī)污泥出料口取樣，分別于06:00、10:00和14:00取等量樣品混合均勻；蘑菇渣、生物質(zhì)炭、微生物發(fā)酵菌、木屑相關(guān)指標(biāo)滿足堆肥要求，經(jīng)檢測，蘑菇渣和木屑中的PAHs含量極低，均低于檢出限，而試驗(yàn)用的木屑取自森林，蘑菇渣經(jīng)過優(yōu)選，受抗生素影響較小，生物質(zhì)炭和微生物發(fā)酵菌復(fù)配量少，可忽略其本底值[20]；堆肥裝置采用定制保溫不銹鋼罐，規(guī)格為直徑60 cm、高60 cm，內(nèi)置自動(dòng)攪拌裝置，加蓋密封. 采用鼓風(fēng)機(jī)曝氣，鼓風(fēng)機(jī)風(fēng)量控制在0.2 m3/h左右[20].

16種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)樣品1 mL (UREA-REPAH107，New Zealand)，包括苊(Ace)1 000 μg/mL、蒽(Ant)100 μg/mL、苯并蒽(BaA)100 μg/mL、熒蒽(Fluo)200 μg/mL、1,2-苯并菲(Chry)100 μg/mL、芴(Flu)200 μg/mL、萘(Nap)1 000 μg/mL、菲(Phe)100 μg/mL、芘(Pyr)100 μg/mL、苊烯(Acy)2 000 μg/mL、苯并[b]熒蒽(BbF)200 μg/mL、苯并[k]熒蒽(BkF)100 μg/mL、苯并[a]芘(BaP)100 μg/mL、茚并(1,2,3-cd)芘(IcdP)100 μg/mL、二苯并[a,h]蒽(DBA)200 μg/mL和苯并[g,h,i]芘(BghiP)200 μg/mL.

1.2 堆肥試驗(yàn)

將木屑通過10目(相當(dāng)于2 mm)的篩網(wǎng)，收集篩下的碎木屑，蘑菇渣切割成0.5 cm的碎片，生物質(zhì)炭碾碎，通過0.2 cm的分子篩，按照不同的比例分別與蘑菇渣、酸性生物質(zhì)炭和木屑混合進(jìn)行堆肥試驗(yàn)，堆體高50 cm，質(zhì)量約100 kg，混合物料粒徑為0.05～5 cm，C/N為25∶1，含水率為78.5%. 根據(jù)前期研究成果[20]，最佳堆體的成分比例：污泥66.9%、微生物發(fā)酵菌0.1%、木屑20%、蘑菇渣8%和生物質(zhì)炭5%，堆肥產(chǎn)品的粒徑集中在0.25～2 mm之間，占比為66.4%，有機(jī)質(zhì)含量為50.5%，TN、TP和TK的含量分別達(dá)到3.88、0.64和1.10 g/kg，發(fā)芽指數(shù)為183%，各重金屬主要形態(tài)為殘?jiān)鼞B(tài)，Cr、Pb、Ni和Cu的含量分別為88.5、28.5、49.1和158.2 mg/kg.

1.3 土壤改良試驗(yàn)

將堆肥產(chǎn)品用于城市建筑半硬化荒地，地上生長有人工種植的景觀喬木，荒地面積約 1 000 m2，土壤板結(jié)嚴(yán)重，含水率為8.5%，pH約為6.5，TN、TP和TK含量分別為0.05%、0.02%和0.30%. 將土壤改良劑混合肥料樣品(土壤改良劑50 kg，按照1∶3混入普通的農(nóng)田土壤)進(jìn)行土壤改良試驗(yàn). 種植前，先將荒地整平，挖直徑30 cm、深30 cm的小坑，待植物種植后整平，每15 d再追加10 kg樣品. 改良3個(gè)月后，種植的海芋葉片飽滿，株徑2.5 cm，株高60 cm. 取改良的土壤進(jìn)行檢測，含水率為22%～24%，pH為6.8，TN、TP和TK的含量分別為0.30%、0.25%和3.50%.

1.4 PAHs檢測分析

取50 g固體樣品，加入內(nèi)標(biāo)PCB209，在20 ℃、100 Hz條件下超聲萃取3次，每次30 min，并加入10 mL HEX(正己烷)與DCM(二氯甲烷)(體積比為1∶1)的混合液，合并提取液，濃縮至2 mL. 制備好的樣品以氧化鋁、硅膠、無水硫酸鈉先后填充的凈化柱凈化，再以HEX與DCM的混合液洗滌凈化柱，接收洗脫液后濃縮定容至1 mL，待測.

樣品采用氣相色譜-質(zhì)譜儀(7890A GC-5975BMSD，Agilent，美國)進(jìn)行測定，使用HP-5M5柱(30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 μm). 定量分析以選擇性離子監(jiān)測(SIM)模式進(jìn)行. 進(jìn)樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為280 ℃，升溫程序：初始溫度為40 ℃，先以8 ℃/min的速率增至200 ℃，然后以8 ℃/min的速率升至300 ℃并保持10 min[21].

1.5 抗性基因檢測

對污泥(S1)、堆肥產(chǎn)品(S2)和土壤改良樣品(S3)抗性基因檢測. 采用分析數(shù)據(jù)評估及質(zhì)控，對測序的原始數(shù)據(jù)通過FastQC進(jìn)行質(zhì)量評估，并通過Trimmomatic進(jìn)行過濾處理，得到相對準(zhǔn)確的有效數(shù)據(jù)；拼接組裝，使用IDBA_UD對各樣本Clean reads進(jìn)行拼接組裝成長序列contig，根據(jù)reads間的overlap關(guān)系，獲得contig，并對多個(gè)Kmer的組裝結(jié)果進(jìn)行綜合評定，選擇最佳Kmer組裝結(jié)果；采用Prodigal對拼接結(jié)果進(jìn)行ORF預(yù)測，選擇長度大于等于100 bp的基因，并將其翻譯成氨基酸序列[22].

2 結(jié)果與討論

2.1 污泥堆肥試驗(yàn)

根據(jù)前期研究成果[20]，堆體的最高溫度達(dá)到68 ℃，超過50 ℃的時(shí)間達(dá)到15 d(見圖1)，堆肥產(chǎn)品肥效好，堆肥產(chǎn)品的重金屬主要以較穩(wěn)定的殘?jiān)鼞B(tài)存在，不易在自然環(huán)境中溶解析出，發(fā)芽指數(shù)高.

圖1 污泥堆肥溫度變化情況

2.2 堆肥對PAHs的降解作用

PAHs溶解性較低、難降解，在污水處理過程中易被吸附到懸浮的固體顆粒上，從而在污泥顆粒上積累. PAHs具有致癌性，其含量是評估污泥農(nóng)用安全性的重要指標(biāo)[23-24].

污泥和堆肥產(chǎn)品的PAHs檢測分析結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見，污泥堆肥對PAHs的去除率基本都在50%以上，特別是芴、菲和蒽的去除率超過了80%. 統(tǒng)計(jì)分析顯示，堆肥前∑16PAHs(16種PAHs總量)為29.7 mg/kg，堆肥產(chǎn)品中∑16PAHs降至6.3 mg/kg，去除率達(dá)到78.7%，∑PAHs-cancer(具有致癌活性的4～6 環(huán)PAHs總量)從14.5 mg/kg降至3.8 mg/kg，去除率達(dá)到74.1%，∑PAHs-ppc(被我國列入環(huán)境“優(yōu)先污染物”的PAHs總量)從4.9 mg/kg降至1.5 mg/kg，去除率達(dá)到68.6%. 污泥堆肥對毒性最大的一種強(qiáng)烈致癌物——苯并[a]芘的去除率雖然只有65.4%，但剩余含量較低，僅為0.353 mg/kg. PAHs通過微生物體內(nèi)功能性酶的降解作用轉(zhuǎn)化為簡單的有機(jī)物中間體，從而被生物進(jìn)一步利用，如真菌通過分泌單加氧酶將單個(gè)原子引入PAHs，產(chǎn)生環(huán)氧化物中間體，耦合水分子形成反式二醇和酚類；細(xì)菌類主要通過分泌雙加氧酶將兩個(gè)氧原子引入PAHs，產(chǎn)生二氧化物中間體，再進(jìn)一步氧化成順式二醇，而后轉(zhuǎn)化為二輕基化合物，接著苯環(huán)斷開，并進(jìn)一步代謝為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物. 一些環(huán)境微生物經(jīng)過適應(yīng)和誘導(dǎo)可以對PAHs進(jìn)行代謝分解，甚至礦化[25-26]. 堆肥對PAHs的降解率較高，但產(chǎn)品中的∑16PAHs仍超過GB 4284—2018《農(nóng)用污泥污染物控制標(biāo)準(zhǔn)》[27]A級污染物限值(5 mg/kg)和B級污染物限值(6 mg/kg).

圖2 污泥和堆肥產(chǎn)品中PAHs的含量及其去除率

選出堆肥產(chǎn)品中含量最高的4種PAHs——蒽、苯并蒽、1,2苯并菲和苯并[k]熒蒽，進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)和檢測分析，其隨時(shí)間的降解情況如圖3所示.

圖3 堆肥產(chǎn)品中含量最高的4種PAHs的降解情況

由圖3可見，在污泥堆肥前期，4種難降解PAHs的含量變化比較明顯，前8 d的其去除率均超過50%，這是因?yàn)楦鹘M分在堆肥過程中的降解主要取決于微生物的降解作用，溫度越高，微生物活性越強(qiáng)，PAHs的去除率也越高. 在堆肥進(jìn)行到第12天時(shí)，上述組分含量基本趨于穩(wěn)定，到第16天時(shí)去除率基本維持不變，這是因?yàn)?，在堆肥過程中PAHs的降解與污泥的腐殖化反應(yīng)緊密相關(guān)，在污泥堆肥后期，污泥堆肥產(chǎn)品逐漸穩(wěn)定，微生物活性降低，去除率隨之降低.

分析結(jié)果顯示，PAHs的降解情況受苯環(huán)數(shù)量影響也較大，2～3環(huán)PAHs(如蒽)的降解速率較快，去除率較高；5～6環(huán)PAHs如苯并[k]熒蒽的降解速率相對較慢，去除率也不高. 這是因?yàn)?，許多微生物(如假單胞菌屬、黃桿菌屬、諾卡氏菌屬等)能以環(huán)境中的低分子量(2～3環(huán))PAHs作為唯一的碳源和能源，并將其完全無機(jī)化，高分子量(4～6環(huán))PAHs的可溶性差，比較穩(wěn)定，難以降解，只有少數(shù)微生物(如白腐菌、煙管菌等)可以通過與其他有機(jī)質(zhì)的共代謝等作用進(jìn)行降解[7-8].

2.3 抗性基因消解效果分析

堆肥過程中共檢測出308種抗性基因，其中241種抗性基因的檢出率為100%. 在污泥(S1)中共檢出255種抗性基因，相對豐度范圍為0～67.8%；堆肥產(chǎn)品(S2)中共檢測出295種抗性基因，相對豐度范圍為0～71.8%；土壤改良樣品(S3)中共檢測出299種抗性基因，相對豐度范圍為0～70.2%(見圖4). 該結(jié)果表明，隨著堆肥時(shí)間的進(jìn)行，抗性基因的種類呈輕微上升趨勢. 大環(huán)內(nèi)脂類和桿菌肽類抗性是檢測出的2種最主要的抗性基因，其中，大環(huán)內(nèi)脂類抗性基因種類在污泥樣品、堆肥產(chǎn)品和施肥土壤中分別占所有抗性基因種類的24.4%、25.7%和25.3%，表明堆肥對大環(huán)內(nèi)脂類抗性基因的消減效果并不明顯；桿菌肽類抗性基因種類分別占所有抗性基因種類的10.8%、9.6%和9.9%，說明桿菌肽類抗性基因種類在堆肥過程中呈現(xiàn)輕微下降趨勢，且施肥于土壤后出現(xiàn)遷移.BL2a_1(青霉素)、BL2b_rob(CP)、BL2e_y56(頭孢菌素)、BL3_cphA(CCCP)、FosA(磷霉素)、VanXD(VT)、dfrA24(甲氧下氨嘧啶)、catA16(氯霉素)、catA7(氯霉素)、catB5(氯霉素)及tetPA(四環(huán)素)等抗性基因在堆肥過程中被完全消減，消減率達(dá)到100%. 同時(shí)，136種抗性基因在堆肥過程中出現(xiàn)了不同程度的消減，其中，BL1_asba(頭孢霉菌素)、BL1_och(頭孢霉菌素)、BL1_pse(頭孢霉菌素)、BL2_veb(CP)、BL3_vim(CCCP)、EreA(紅霉素)、ErmO(LSM)、FosX(磷霉素)、MdtM(CAN)、QnrB(氟喹諾酮)、QnrS(氟喹諾酮)、SmeB(氟喹諾酮)、VanWB(萬古霉素)、VanWG(萬古霉素)、VatC(鏈陽性菌素)、VgbB(鏈陽性菌素)、catB4(氯霉素)、cmL_e8(氯霉素)及(四環(huán)素)這19種抗性基因在堆肥過程中的消減率超過85%. 抗性基因的消解是因?yàn)槲⑸镌谒峄夂臀浇到獾倪^程中，部分功能微生物出現(xiàn)衰亡，細(xì)胞裂解釋放的DNA與胞外DNA同時(shí)被水解或生物降解. 這一過程需要在特定的溫度、濕度和pH條件下，并通過微生物體內(nèi)功能性核酸酶的催化降解作用，觸發(fā)抗性基因的消解，DNA分子逐漸脫穩(wěn)，部分雙鏈分子結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湻肿咏Y(jié)構(gòu)，同時(shí)，磷酸二酯鍵斷裂、氫鍵穩(wěn)定性降低、末端堿基脫落，抗性基因得到有效消解，這與已有研究結(jié)果[28-30]基本一致.

圖4 堆肥過程中群落結(jié)構(gòu)變化

研究表明，微生物群落結(jié)構(gòu)的變化是決定抗性基因多樣性的重要因素之一[31-32]，筆者通過對堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Shannon-Wiener指數(shù)在堆肥過程中變化不明顯. 堆肥過程中門水平上的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，污泥樣品被分為103個(gè)門類，其中變形桿菌門、放線桿菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、硝化螺旋菌門及厚壁菌門是其主要門類，分別占45.2%、19.0%、14.4%、8.5%、4.0%、1.8%及1.3%. 堆肥產(chǎn)品的微生物群落被分為102個(gè)門，其中放線桿菌門占比最大，達(dá)到42.8%，其次分別是變形桿菌門和擬桿菌門，分別占26.2%和21.5%. 施肥于土壤后微生物群落被分為104個(gè)門，其中放線桿菌門仍然占比最大，達(dá)到45.5%，其次是變形桿菌門和擬桿菌門，分別占26.9%和19.1%. 上述結(jié)果表明，堆肥及施肥過程中微生物群落在門水平結(jié)構(gòu)上未發(fā)生明顯變化，這與Shannon-Wiener指數(shù)變化情況相對應(yīng)，其次放線桿菌門含量在堆肥過程中呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢. 進(jìn)一步分析堆肥過程中屬水平上微生物群落的變化，結(jié)果表明，污泥樣品中假單胞菌屬、分枝桿菌屬、酸桿菌屬、出芽菌屬及短根瘤菌屬是其主要的屬，分別占17.1%、15.3%、6.7%、5.4%及4.1%. 堆肥產(chǎn)品中分枝桿菌屬、黃桿菌屬、隱桿菌屬、棒狀桿屬和鞘氨醇桿菌屬轉(zhuǎn)變成為其主要的屬，分別占34.4%、3.7%、2.3%、2.0%和1.8%. 施肥土壤中分枝桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、中慢生根瘤菌屬及棒狀桿菌屬成為其主要菌屬，分別占32.9%、2.9%、2.5%、2.0%及1.8%. 該結(jié)果表明堆肥及施肥過程中微生物群落在屬水平上發(fā)生了較大變化，其中分枝桿菌屬和鞘氨醇桿菌屬的占比在堆肥過程中不斷增加，屬水平上微生物群落的變化可能與堆肥過程中抗生素類物質(zhì)的降解有關(guān)[33-34].

3 結(jié)論

a) 添加輔料進(jìn)行共堆肥，能夠促進(jìn)污泥堆肥的腐熟，對PAHs的降解效果較好. 共堆肥能夠促進(jìn)污泥中PAHs的降解，去除率基本都在50%以上，特別是芴、菲和蒽的去除率都超過了80%. ∑16PAHs的去除率達(dá)到78.7%，∑PAHs-cancer的去除率達(dá)到74.1%，∑PAHs-ppc的去除率達(dá)到68.6%. 但堆肥后∑16PAHs的總量為6.3 mg/kg，超過GB 4284—2018《農(nóng)用污泥污染物控制標(biāo)準(zhǔn)》A級污染物限值(5 mg/kg)和B級污染物限值(6 mg/kg)，且PAHs具有致畸性、致癌性和致突變性，在環(huán)境中難降解、易累積，PAHs經(jīng)過低等生物體的吸收、富集而產(chǎn)生的危害可以通過食物鏈進(jìn)入人體. 因此，施肥土壤仍存在一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估后施用.

b) PAHs的降解受溫度和持續(xù)高溫時(shí)間的影響較大，溫度越高，持續(xù)時(shí)間越長，PAHs的去除率也越高. PAHs各組分的降解與本身的結(jié)構(gòu)亦相關(guān)，低分子量(2～3環(huán))PAHs的去除率較高，高分子量(4～6環(huán))PAHs的去除率相對較低.

c) 多種抗性基因在堆肥過程中出現(xiàn)了不同程度的消減，其中，BL2a_1(青霉素)、catB5(氯霉素)和tetPA(四環(huán)素)等11種抗性基因在堆肥過程中完全消減，消減率均達(dá)到100%，BL1_asba(頭孢霉菌素)、EreA(紅霉素)、QnrB(氟喹諾酮)和cmL_e8(氯霉素)等19種抗性基因在堆肥過程中消減率均超過85%，可見堆肥過程能有效消減該類抗性基因.

d) 堆肥過程中抗生素類物質(zhì)的降解影響了屬水平上微生物群落的變化，其中分枝桿菌屬和鞘氨醇桿菌屬在堆肥過程中變化明顯，堆肥產(chǎn)品及施肥土壤中屬水平上微生物菌落的不確定性影響了污泥產(chǎn)品的農(nóng)業(yè)施用，有待進(jìn)一步深入研究.