劉后偉 廖章鵬 李瑞瑩 洪利鶴 李霖楓 黃標 姚小華

摘要 對湛江農(nóng)墾成齡和幼齡劍麻紫色卷葉病田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，一般抗病苗與普通苗發(fā)病率為18%～33%，之間無顯著差異，而高抗病苗能有效對抗紫色卷葉?。òl(fā)病率近0）;列聯(lián)表分析表明劍麻的抗病、發(fā)病、死亡等現(xiàn)象不是相互獨立的隨機事件，存在未知關聯(lián);根據(jù)田間劍麻種植布局，每株周圍劍麻分為直接接觸和非直接接觸兩類，調(diào)查發(fā)現(xiàn)直接接觸生病劍麻數(shù)量水平?jīng)Q定了發(fā)病率高低（相關系數(shù)為0.976），每增加一株病麻，劍麻發(fā)病率提高13.6%，而非直接接觸生病劍麻數(shù)對發(fā)病率的影響呈彌散狀，說明直接接觸傳染是紫色卷葉病擴散的重要因素;無論是單塊成齡或幼齡劍麻田，還是二者合并，紫色卷葉病發(fā)病率分布都存在不發(fā)病和高發(fā)病2個峰，推測存在2種以上的因子影響劍麻發(fā)病，為此提出抗病因子和非抗病因子2個因子共同決定劍麻紫色卷葉病的雙因子模型，這2類因子的相互作用決定了劍麻染病、恢復、再染病、再恢復的循環(huán)，能夠解釋目前紫色卷葉病表現(xiàn)。

關鍵詞 田間調(diào)查;紫色卷葉病;發(fā)病率;直接接觸傳染;傳病因子

中圖分類號 S-435.63? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）11-0132-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.11.037

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Field Investigation of Sisal Purple Leaf Roll Disease and Its Disease-carried Factor Analysis

LIU Hou-wei1，LIAO Zhang-peng1，2，LI Rui-ying1 et al

（1. College of Tropical Agriculture and Forestry， Guangdong AIB Polytechnic， Guangzhou， Guangdong 511368;2.School of Life Sciences，Jiaying University，Meizhou，Guangdong 514011）

Abstract Field investigations of purple leaf curl disease of sisal in Zhanjiang，Guangdong of China revealed that the incidence rates of plants grown from common resistant seedlings or non-resistant seedlings fluctuate were between 18% and 33%， and there were no significant differences between them. The high resistant seedlings were effectively against purple leaf curl disease， the incidence rate was nearly 0. Contingency table analysis showed that disease resistance， disease incidence and death of sisal were not independent random events， but had unknown associations;according to the planting layout of sisal in the field， each plant around the sisal was divided into direct contact and non-direct contact two categories. The survey found that the number of sick sisal within direct contact sisal determined the incidence of purple leaf curl disease （correlation coefficient = 0.976， slope=13.6%）， but the influences of the number of sick sisal within non-direct contact sisal were much weak， which indicated that direct contact infection should be an important route in the spread of purple leaf curl disease. For the distribution of the incidence rate of purple leaf disease had two peaks with zero incidence and the highest incidence， it was speculated that there were more than two factors affecting the incidence. The two-factors model was proposed to explain the cycle of infection， recovery， re-infection， and re-recovery at all stages of sisals life. Therefore， we put forward the two-factors model of sisal purple leaf curl disease， which was jointly determined by the interaction of disease-resistant factors and non-disease-resistant factors. The interaction of these two kinds of factors determined the cycle of infection， recovery， re-infection and recovery of sisal hemp， and could explain the current performance of purple leaf curl disease in field.

Key words Field investigation;Purple leaf curl disease;Incidence rate;Direct contact infection;Disease-carried factor

劍麻（Agave Sisalana Perr. Ex Engelm.）紫色卷葉病由劍麻新菠蘿灰粉蚧（簡稱為粉蚧）傷害所致[1]，但在多年反復感染粉蚧病死的老麻田長出的新苗，雖也能被粉蚧所傷，但不會出現(xiàn)紫色卷葉病癥狀（這些苗也稱為抗病苗），實踐發(fā)現(xiàn)，抗病性只能在無性繁殖的腋苗和走莖苗之間傳遞2～3代，且隨著種植時間的延長，抗病效果會逐漸減弱，適度傳染粉蚧反而可以維持這種抗病性[2-3]，這表明抗病性的獲得不是劍麻遺傳物質(zhì)的改變，更可能是某種適應性的變化。王桂花等[4]通過巢式PCR技術，從新菠蘿灰粉蚧分離到與紫色卷葉病含有的植原體相同的1.2 kd DNA片段，劍麻紫色卷葉病是否由植原體所致還需更多的證據(jù)，黃標等[5]排除了紫色卷葉病由真菌、細菌、線蟲病害等引起，到目前為止，劍麻紫色卷葉病病因仍是一個未解之謎。

2019年，對湛江雷州英利鎮(zhèn)東風紅農(nóng)場的15塊種植時間為1.5～8.0年的劍麻地進行抽樣調(diào)查，發(fā)現(xiàn)發(fā)病株在田間呈斑塊狀，以田間同一畦相鄰20株為一組，比較不同地塊之間發(fā)病率的差異，統(tǒng)計發(fā)病率分布，發(fā)現(xiàn)除高抗苗田外，其他劍麻田發(fā)病率分布都存在2個峰;通過按坐標方位位置標記正常、紫色卷葉病、死亡的劍麻株，統(tǒng)計每株直接接觸劍麻中有病株數(shù)量（簡稱直接病麻數(shù)），非直接接觸劍麻中有病株數(shù)量（簡稱非直接病麻數(shù)），分析直接病麻數(shù)和非直接病麻數(shù)與劍麻發(fā)病率的關系，實證紫色卷葉病存在直接接觸傳播的途徑。上述2種方法，結(jié)合植株坐標位置信息進行性狀變量的分類統(tǒng)計，有一定的普適性，可以應用于多年生密集種植作物的傳染病調(diào)查，為植物傳染病調(diào)查提出新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 湛江農(nóng)墾種植劍麻品種為H.11648，系多年生植物，生長周期8～12年，開花然后死亡。第1～2年劍麻為幼苗，2年后為成齡劍麻，移種大田。

1.2 調(diào)查方法 在幼齡劍麻田（抗性苗）、成齡劍麻田（高抗性苗、抗性苗、非抗性苗）隨機取相鄰的4～12行，設定起始位置，從起始位開始，逐株記錄劍麻狀況，標記坐標紙上，0為未病株，1為紫色卷葉病株，-1代表死亡株。

調(diào)查15塊地，分散在東方紅農(nóng)場劍麻種植園區(qū)，8塊為成齡劍麻田，種植時間為5～8年;幼苗劍麻田7塊，種植時間1.5年;劍麻總數(shù)為9 052株，非抗性劍麻1 200株，高抗性苗1 200株，成齡抗病劍麻2 544株，抗病幼苗4 112株，抗性苗發(fā)病率最低0.0%，最高63%，非抗性苗發(fā)病率為28%～37%，未見明顯規(guī)律，調(diào)查田塊的信息和數(shù)量見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

1.3.1 不同地塊發(fā)病率比較方法及其驗證。

不同種苗、不同地塊的紫色卷葉病發(fā)病情況，采用2種方法進行分析：第一種方法將地塊的劍麻按一畦上10行為一小組（20株/組），統(tǒng)計其中正常、發(fā)病、死亡的數(shù)量，得出每小組的發(fā)病率、死亡率，被調(diào)查的田地有23～36小組（絕大部分為30小組），計算方差，進行地塊之間的F檢驗和t檢驗;第二種方法采用列量表分析，劍麻有高抗病苗、抗病苗和普通苗，根據(jù)無病、有病、死亡3種情況形成3×3矩陣，矩陣（i，j）單元田間調(diào)查值（頻數(shù)）為nij，如果所有因素兩兩獨立，通過邊緣分布概率計算出頻數(shù)期望值為

μij=ni+×n+j/n（ni+為第i行頻數(shù)和，n+j為第j列頻數(shù)和，n為所有頻數(shù)和），理論計算值μij與實際值nij偏離的程度可由χ2值判斷，其χ2值計算公式：

χ2=（μij-nij）2μij

χ2自由度為（3-1）×（3-1）= 4，α=0.05和α=0.01的χ2臨界值為9.488和13.277，如果實際χ2值大于這2個值，有95%或99%的可能性認定高抗病苗、抗病苗和普通苗與無病、有病、死亡不是兩兩沒有關聯(lián)的（拒絕H0假設，就受H1假設）[6]。

1.3.2 劍麻紫色卷葉病傳染方式分析的原理和方法。劍麻采用雙行長行種植，成齡劍麻種在寬1.6 m畦上，植株間相間1.0 m×1.0 m，畦高25～30 cm，畦間有4 m的溝;幼齡劍麻的畦寬90 cm，畦高15～20 cm，畦間有50 cm的溝，苗種植相間50 cm×50 cm，其截面相對位置見圖1。

成齡劍麻底層葉長1.0～1.2 m，大致45°角向四周生長，投射地面相當于半徑70～85 cm的圓（圖2淺綠的圓），相鄰的劍麻莖葉之間相互重疊，但不同畦之間不會相互接觸;幼齡劍麻葉長30～50 cm，以45°～60°夾角向四周生長，投影地面相當于21～43 cm的圓（圖2中淺紅色的圓），同樣，同畦幼齡劍麻苗葉片之間會相互接觸，不同畦之間劍麻間隔1.2 m，有50 cm的作業(yè)走道，劍麻葉不會重疊[7-8]。

任何一株劍麻，與其直接接觸相鄰植株有5株（圖2中的淺黃色U型區(qū)域），而邊緣種植的劍麻相鄰的為3株;非直接接觸相鄰劍麻有3株，為相鄰畦上同行劍麻，及其上下劍麻（圖2中淺綠色的3個圓），邊緣劍麻非直接接觸相鄰劍麻為0或2株。

假定劍麻紫色卷葉病是一種傳染病，單獨分析直接接觸劍麻與間接接觸劍麻對其發(fā)?。剩┑挠绊懣梢杂脕砼袛嘣摬∈欠裢ㄟ^直接接觸傳染或非直接接觸傳染，該研究通過2個側(cè)面來反映這種影響，方法一，按直接病麻數(shù)（或非直接病麻數(shù)）對劍麻進行分類，統(tǒng)計具有相同直接病麻數(shù)的不同地塊劍麻總數(shù)和病麻數(shù)（邊緣的劍麻不納入統(tǒng)計，忽略），和相同非直接病麻數(shù)的不同地塊劍麻總數(shù)和病麻數(shù)（為了消除直接接觸有病劍麻對分析的干擾，只統(tǒng)計直接病麻數(shù)=0的情況），做散點圖，不同地塊對應散點圖中不同的點，分析點之間的關系，判斷發(fā)病率（斜率）是否一致（所有點聚集在一條直線周邊），以此推斷該疾病是隨機發(fā)病（呈發(fā)散狀）還是通過傳染發(fā)?。ㄓ薪咏陌l(fā)病率）;方法二，通過Pearson相關分析[6，9-10]，分析劍麻紫色卷葉病的概率（發(fā)病率）與直接接觸相鄰（非直接相鄰）的有病劍麻數(shù)是否存在強烈正相關，來推導有病劍麻傳病能力是否有疊加性和能否影響周邊劍麻染病，推斷紫色卷葉病的傳病原因。

1.3.3 數(shù)據(jù)采集和處理軟件。

田間調(diào)查起始位置隨機指派，數(shù)據(jù)采集由東方紅農(nóng)場科研所工作人員和廣東農(nóng)工商職業(yè)技術學院的學生完成，錄入電腦進行分析處理，數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS軟件處理[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地塊抗病性劍麻品種紫色卷葉病發(fā)病率比較

劍麻的種苗分為高抗病苗、抗病苗和普通苗，在調(diào)查中，3種劍麻在被新菠蘿粉蚧感染后平均發(fā)病率分別0、0.408、0.325，抗病苗的平均發(fā)病率反而高于普通苗，其原因值得進一步探討。地塊發(fā)病率分布見表2。

對地塊進行ANOVA單因素方差分析，結(jié)果表明，組間和組內(nèi)方差為10.806和18.717，F(xiàn)值為17.773，存在顯著差異，說明不同地塊的發(fā)病率差異明顯。Tukey統(tǒng)計[10]分析將地塊分為3組：3-2#、3-3#高抗病株（發(fā)病率為0）;13-3#、11-3#抗病苗（發(fā)病率為0.56%、0.63%）;其他地塊為一組（發(fā)病率為0.18%～0.37%）。普通苗和抗病苗之間的發(fā)病率無顯著差異。

新菠蘿灰粉蚧感染劍麻，蠶食劍麻新葉生長部位，對劍麻造成傷害，粉蚧通過螞蟻搬運至周邊的劍麻，似乎可以解釋劍麻通過密切接觸傳病，但感染粉蚧不一定導致紫色卷葉病，實際上在大田，幾乎所有的劍麻都有粉蚧的感染跡象，仍存在一定劍麻不會出現(xiàn)紫色卷葉病的癥狀（20%左右，圖3灰色的柱），表明還有其他因子阻止紫色卷葉病的產(chǎn)生。由此可知，劍麻發(fā)病率分布存在2個峰：在0的位置和均值位置。對單塊田地劍麻分析，都呈相似形狀。說明存在不同的因子影響劍麻的紫色卷葉病。

2.2 列聯(lián)表統(tǒng)計和Gamma等級相關分析

列聯(lián)表分析，可以判斷各種因素之間是否存在關聯(lián)。列聯(lián)表統(tǒng)計僅限于成齡劍麻。橫向分為無病、有?。ㄌ刂缸仙砣~病）、死亡3種情形，縱向分為高抗性苗、抗性苗、普通苗，組成3×3的列聯(lián)表，假設上述6個因素對劍麻的影響是兩兩相互獨立，由此得到期望頻數(shù)值（表3格括號中值），計算出χ2值和為703.60，自由度df=4，顯著性水平α=0.005，χ2值為14.86，存在顯著差異，說明劍麻有病、死亡不是隨機出現(xiàn)的，其后存在導致劍麻生病、死亡的不明因素（表3）。

Gamma等級相關系數(shù)[10]為-0.125，接近0，Gamma系數(shù)顯示大田劍麻是否染病與抗病苗的關系復雜，需要深入剖析。

2.3 直接病麻數(shù)與紫色卷葉病的關系

2.3.1 不同直接病麻數(shù)水平下不同地塊劍麻總數(shù)與病麻數(shù)的關系。

統(tǒng)計成齡劍麻和幼齡劍麻每株的直接病麻數(shù)（高抗病苗沒有病麻未納入統(tǒng)計），然后按直接病麻數(shù)分類，結(jié)果見表4。

將不同直接病麻數(shù)水平的劍麻數(shù)與病麻數(shù)繪制散點圖（圖4），結(jié)果表明，當直接病麻數(shù)水平低，點分布較發(fā)散，隨著水平增加，分布越來越集中一條直線上;直接病麻數(shù)水平低時，點集中在靠近X軸，隨著水平增加，點越來越遠離X軸，病劍麻的傳病能力是可以疊加的。? 劍麻總數(shù)與病麻數(shù)Pearson相關系數(shù)及其t檢驗（H0：相關系數(shù)=0;H1：相關系數(shù)≠0）見表5，直接病麻數(shù)為0時，劍麻總數(shù)與病麻數(shù)相關系數(shù)接近0，說明田間劍麻在感染新菠蘿灰粉蚧后，不同地塊上劍麻單獨發(fā)病率是波動的、沒有規(guī)律，導致紫色卷葉病的致病因子隨機作用;而當直接病麻數(shù)為5時，相關系數(shù)為0.995，感染率為79.9%，并未100%染病，顯示存在某種未知的因素，阻止劍麻生病。

2.3.2 不同直接病麻數(shù)水平下的紫色卷葉病發(fā)病率。

直接病麻數(shù)水平從0到5，紫色卷葉病發(fā)病率從0.119提升到0.799，每增加1株直接接觸有病劍麻，劍麻生病概率增加13.6%，在不同直接病麻數(shù)水平下，紫色卷葉病的發(fā)病率見圖5，發(fā)病率的均值分布在斜率為0.136直線周邊（采用最小二乘估計的線性回歸得到），Pearson相關系數(shù)為0.976，與0值的t檢驗值為9.19，存在顯著差異，說明直接接觸的有病劍麻能顯著影響周圍劍麻發(fā)病，田間調(diào)查也發(fā)現(xiàn)紫色卷葉病呈斑塊狀分布，直接接觸病麻傳染是紫色卷葉病可證實的傳染途徑。

2.4 非直接病麻數(shù)與紫色卷葉病的關系

分析非直接病麻數(shù)與劍麻染病的關系需要排除直接接觸有病的劍麻對結(jié)果的干擾，為此只選用直接病麻數(shù)=0劍麻數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。13塊地不同非直接病麻數(shù)水平下劍麻總數(shù)與病麻數(shù)、發(fā)病率與標準差見表6，平均發(fā)病率隨非直接病麻數(shù)變化不明顯，且標準差較大，t檢驗分析表明它們之間不存在顯著差異。

非直接病麻數(shù)不同水平（0～3）的劍麻總數(shù)與病株之間的散點圖見圖6，呈發(fā)散、隨機分布，不存在明顯的相關性，表明非直接病麻數(shù)與劍麻生病關系不明顯，非直接接觸的病麻傳染不是紫色卷葉病傳染的主要途徑。

2.5 雙因子模型

猜想劍麻紫色卷葉病是由2種作用相反的因素——抗病因子和非抗病因子共同作用所引起，當抗病因子占優(yōu)勢時，劍麻呈抗病狀態(tài);當非抗病因子占優(yōu)勢時，劍麻呈敏感狀態(tài)。這些因子可以受限傳遞、不能遺傳，在一定條件下消失，也可重新出現(xiàn)，它們的波動導致劍麻會多次出現(xiàn)染病、恢復、再染病、再恢復的循環(huán)。為此，提出劍麻紫色卷葉病發(fā)病和抗病的雙因子模型，粉蚧、抗病苗、非抗病苗、抗病因子和非抗病因子等與劍麻紫色卷葉病的關系見圖7，模型將抗病因子和非抗病因子認為是劍麻之外的因素，劍麻的抗病狀態(tài)和非抗病狀態(tài)是由這兩類因子相互作用引起，很好解釋抗病性不能遺傳和粉蚧的感染可以強化劍麻抗病性等問題，但模型中提出的抗病因子和非抗病因子是什么不得而知，一項迫切任務就區(qū)分劍麻的抗病因子和非抗病因子，找出和分離抗病因子，通過抗病因子在劍麻內(nèi)的擴增解決劍麻紫色卷葉病問題。

3 結(jié)論與討論

劍麻紫色卷葉病自21世紀初從海南傳到湛江，逐漸在廣東、廣西、福建等主要產(chǎn)麻區(qū)擴散，成為劍麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展的難疾，其致病機理至今沒有闡明，對此也缺乏有效的防控手段。當常規(guī)的研究手段難以解開病因，通過田間傳播的特點來推斷其傳病原因不失為一種有效的手段，在這點上劍麻有獨特的優(yōu)勢：與生命周期短的作物不同，劍麻為多年生植物，劍麻之間的相對位置長期固定，劍麻受到周邊其他劍麻影響，也影響周邊別的劍麻，相互關系穩(wěn)定，為分析劍麻紫色卷葉病的傳播方式提供了便利。

非直接病麻對劍麻生病的影響是在直接病麻數(shù)為0的水平進行，排除了直接接觸的有病劍麻對分析結(jié)果的影響。直接病麻數(shù)0水平下，劍麻發(fā)病率隨非直接病麻數(shù)呈隨機分布，它們間相關系數(shù)接近0，隨著直接病麻數(shù)水平增加，相關性增加，在直接病麻數(shù)5水平上，相關系數(shù)為0.998，在同一個直接病麻數(shù)水平，所有非直接病麻數(shù)的增加值（斜率）十分接近，說明這種增加是由直接病麻數(shù)帶來的，而不是非直接病麻變動所致，從另一個方面證明非直接接觸有病劍麻對劍麻是否染上紫色卷葉病作用很小，紫色卷葉病是通過直接接觸的有病劍麻傳播的。

直接病麻數(shù)（近距離）和非直接病麻數(shù)（長距離）2種數(shù)據(jù)的區(qū)分對于劍麻這種種在畦上、且有中間作業(yè)通道的農(nóng)作物合理，類似的研究方法可以應用于密集種植、多年生植物的傳染病調(diào)查，如火龍果、香蕉、多年生果園等。劍麻是淺根系植物，自然生長劍麻根可以向四周擴張5 m，不同畦的植物地下根可能會接觸，但考慮到每年有施肥、中耕、除草和采收，加之套種假花生等植物，實際上接觸可能性不大。至于在直接接觸外圍劍麻，它們的影響需要通過跨越直接接觸劍麻，在該研究中沒有考慮，希望今后的研究中能夠彌補。

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