陳思懷 李德龍 高繼業(yè)

摘要 為了克服小鼠組織器官傳統(tǒng)石蠟切片制作方法存在組織易碎、結(jié)構(gòu)不完整的缺點(diǎn)，對(duì)傳統(tǒng)石蠟切片制作進(jìn)行了改良。將浸蠟前的透明步驟改為異硬脂醇與石蠟混合液處理，替代苯類透明劑制作空腸、脾臟2種器官的石蠟切片，并以切片機(jī)切片時(shí)蠟帶質(zhì)量和HE染色后鏡下質(zhì)量為切片制作效果的評(píng)定指標(biāo)。結(jié)果表明，2種器官在切片機(jī)上均能切出完整、較長(zhǎng)的蠟帶，組織塊無硬化、不碎裂，展片平整;HE染色過程中不掉片，染色后光鏡下細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核染色對(duì)比清晰，器官組織結(jié)構(gòu)完整。就脾臟和空腸而言，應(yīng)用異硬脂醇與石蠟混合液替代苯類透明劑能制作出優(yōu)良的石蠟切片。

關(guān)鍵詞 石蠟切片;異硬脂醇;透明劑;小鼠

中圖分類號(hào) R-361.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）11-0094-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.11.025

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Improvement of Preparation Method of Paraffin Sections of Some Tissues and Organs in Mice

CHEN Si-huai，LI De-long，GAO Ji-ye

（College of Veterinary Medicine，Southwest University， Chongqing 402460）

Abstract In order to overcome the defects of fragile tissue and incomplete structure in the traditional paraffin section preparation method of mice tissues and organs， the traditional preparation method of paraffin section was improved.Paraffin sections about jejunum and spleen were made with the mixed solution of isostearin and paraffin instead of benzene transparent agents.The quality of ribbon and microscopic observation after HE staining were selected as judgment indices .The results showed that two kinds of representative organs could be cut into long and complete wax bandes on the microtome， and flatten out with no hardening or non-fragmentation.After HE staining， the cytoplasm and nucleus were stained clearly， and the structures of organs and tissues were intact.As for jejunum and spleen，the mixture of isostearic alcohol and paraffin could be used to treat the tissues instead of benzene transparent agents to make good paraffin sections.

Key words Paraffin section;Isostearic alcohol;Transparent agent;Mice

小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其組織器官在大小、質(zhì)地等方面不同于成年畜禽，如小腸壁薄、肝細(xì)胞脂類豐富、脾臟小等。在開展教學(xué)或病理石蠟切片制作時(shí)，采用傳統(tǒng)制片方法，以二甲苯作為浸蠟前透明劑，容易造成切片破碎、組織分離或結(jié)構(gòu)龜裂。鑒于二甲苯等苯類物質(zhì)對(duì)健康的危害以及處理組織塊需特定技術(shù)與經(jīng)驗(yàn)等缺點(diǎn)，許多學(xué)者報(bào)道了應(yīng)用無毒的硬脂酸（十八烷酸）與石蠟的混合液替代浸蠟前二甲苯透明劑的使用，并成功制作出優(yōu)良的動(dòng)物組織石蠟切片[1-2]。但是，該方法有以下缺點(diǎn)：一是細(xì)胞內(nèi)硬脂酸若未被石蠟置換完全，容易導(dǎo)致染色掉片，影響鏡下觀察效果;二是硬脂酸熔點(diǎn)高，與石蠟混合需較高的溫度（≥67 ℃）來保持熔融狀態(tài)，這使小鼠組織器官更容易硬化、脆化[3]。異硬脂醇（異構(gòu)十八烷醇）是一類C18飽和支鏈脂肪醇混合物，常溫下呈液態(tài)，無色、無味、無毒[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，異硬脂醇與石蠟、乙醇相容性好，符合浸蠟前透明劑的特征，但目前國(guó)內(nèi)外尚無應(yīng)用異硬脂醇開展石蠟切片的報(bào)道。筆者選擇異硬脂醇作為透明劑，制作小鼠空腸（代表中空性器官）、脾臟（代表實(shí)質(zhì)性器官）的石蠟切片，旨在為傳統(tǒng)石蠟切片制作方法的改良奠定基礎(chǔ)，為病理診斷或教學(xué)應(yīng)用的石蠟切片制作提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物組織 4%甲醛固定的健康小鼠（清潔級(jí)）空腸、脾臟器官。

1.2 主要試劑與儀器 主要試劑有異硬脂醇（AR級(jí)，山東優(yōu)索化工有限公司）、軟蠟（48～50 ℃，上海華永石蠟有限公司）、硬蠟（56 ℃，Leica，USA）等;主要儀器有石蠟切片機(jī)（Leica RM2015，上海萊卡儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法 取固定好的組織塊按常規(guī)修塊（實(shí)質(zhì)性器官厚1 mm，中空性器官長(zhǎng)3 mm）、流水沖洗、梯度乙醇脫水（70%～100%，每級(jí)1.5 h），再經(jīng)異硬脂醇與軟蠟的混合液（1∶4）置換2 h（混合液Ⅰ、Ⅱ 2級(jí)，每級(jí)1 h，52 ℃），浸透硬蠟2 h（硬蠟Ⅰ、Ⅱ 2級(jí)，每級(jí)1 h，58 ℃），包埋后5 μm切片，42 ℃展片，其他步驟（脫蠟、染色、透明、封片）同傳統(tǒng)制片法。最后，以切片機(jī)切片時(shí)蠟帶質(zhì)量和HE染色后鏡下切片質(zhì)量作為改良方法的評(píng)價(jià)依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟帶質(zhì)量 2種組織器官12 μm修塊時(shí)均表現(xiàn)為軟硬適中，未出現(xiàn)組織塊硬化碎裂和切片的嚴(yán)重褶縮，表明浸蠟充分。5 μm切片時(shí)未見蠟片破碎、壓縮，并能形成較長(zhǎng)的連續(xù)蠟帶（圖1）。蠟帶在溫水中展片能快速展平，厚薄均勻，切片中的組織完整，與周圍石蠟緊密融合，未見分離（圖2）。

2.2 光鏡下切片質(zhì)量 空腸切片低倍鏡下可見腸壁的黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層4層結(jié)構(gòu)完整;高倍鏡下可見縱切或橫切的絨毛，未見制片造成的上皮脫落，絨毛的單層柱狀上皮完整，核質(zhì)對(duì)比清晰，絨毛表面的微絨毛（紋狀緣）清楚（圖3），其余3層結(jié)構(gòu)未見分離，尤其漿膜保留完整（圖4）。脾臟在低倍鏡下富含平滑肌的被膜結(jié)構(gòu)完好，實(shí)質(zhì)內(nèi)白髓區(qū)、紅髓區(qū)染色對(duì)比均清晰，固有結(jié)構(gòu)完整，未見因制片原因造成的龜裂（圖5）;高倍鏡下細(xì)胞形態(tài)正常，白髓區(qū)的中央動(dòng)脈、動(dòng)脈周圍淋巴鞘結(jié)構(gòu)清楚;紅髓區(qū)的脾索、脾竇結(jié)構(gòu)未見人為斷裂與破損（圖6）。由此可見，2種切片的制作質(zhì)量均符合教學(xué)要求和病理診斷觀察要求。

3 討論

制作高質(zhì)量石蠟切片需要注意制作的每個(gè)環(huán)節(jié)，在包埋前的步驟中取材的大小、合適的固定劑、脫水劑（乙醇）的處

理時(shí)間以及透明劑的選擇與處理時(shí)間均較為重要。若實(shí)質(zhì)性器官太厚，會(huì)影響后續(xù)步驟的處理;若固定不好，則會(huì)影響細(xì)

胞結(jié)構(gòu);脫水時(shí)間尤其是高濃度乙醇處理時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致組織塊硬化，切片時(shí)易碎;浸蠟前透明處理是整個(gè)過程中最關(guān)鍵的步驟，傳統(tǒng)制片法中二甲苯的透明效果較好，但需要操作者根據(jù)制片經(jīng)驗(yàn)判斷透明要求，容易造成菲薄組織（如小腸等）的漿膜透明過度，從而造成該層結(jié)構(gòu)的碎裂或缺失。

為了解決傳統(tǒng)浸蠟前苯類透明劑的健康危害、環(huán)境污染、不同樣品同批次制片難、組織易透明過度等缺陷，國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道了較多的苯類透明劑替代試劑。它們主要是以松節(jié)油或含蒎烯組分為代表的植物精油類[6-8]、叔（正）丁醇與異丙醇為代表的醇類[9-10]、汽油、Van-Clear商品試劑為代表的烷烴或烷烴衍生物類[11-12]。雖然這些替代試劑低毒或無毒，但也存在透明速度慢、溶蠟?zāi)芰θ酢⒂写碳馕?、價(jià)格昂貴以及透明時(shí)間嚴(yán)格等問題，因而未得到推廣應(yīng)用。該試驗(yàn)中使用的異構(gòu)硬脂酸硬脂醇性質(zhì)溫和，與石蠟混合后處理樣品，既可以置換脫水劑，又能增加石蠟的浸入時(shí)間并減少硬蠟的處理時(shí)間，因而組織塊容易成功切片。

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