吳雪 段少宇 梁萍 劉欣

[摘要]目的：探討miR-34a靶向STAT1基因調(diào)控牙周膜細(xì)胞增殖及凋亡的分子機(jī)制。方法：將PDLCs細(xì)胞分成Pm、Py、Pz三組，Pz組（PDLCs細(xì)胞不做任何處理），Pm組（轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物）、Py組（轉(zhuǎn)染miR-34a抑制物），RT-PCR檢測(cè)STAT1、miR-34a水平，Westernblot法檢測(cè)STAT1蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞儀、MTT法分別檢測(cè)PDLCs細(xì)胞凋亡、增殖情況。結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)STAT1、miR-34a水平結(jié)果顯示，與Pz組對(duì)比，Py組STAT1、miR-34a水平有顯著下降，Pm組STAT1、miR-34a水平最高，Pz組STAT1、miR-34a水平其次，Py組STAT1、miR-34a水平最低（均P<0.05）。Westernblot法檢測(cè)STAT1蛋白發(fā)現(xiàn)，與Pz組對(duì)比，Py組STAT1蛋白較Pm組有顯著下降，Pm組STAT1蛋白表達(dá)最高，Pz組蛋白表達(dá)其次，Py組STAT1蛋白表達(dá)最低（均P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Pz組對(duì)比，Pm組PDLCs細(xì)胞凋亡明顯增加，與Pm組對(duì)比，Py組細(xì)胞凋亡明顯降低（均P<0.05），Pm組細(xì)胞凋亡呈三組最高，Pz組其次，Py組最低。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：Pz組PDLCs細(xì)胞在24h、48h、72h時(shí)均緩慢增長(zhǎng)，Py組PDLCs細(xì)胞24h、48h增殖變化較平穩(wěn)，72h時(shí)增殖速度明顯加快，Pm組受miR-34a模擬物影響，PDLCs細(xì)胞數(shù)量增殖緩慢（均P<0.05）。結(jié)論：miR-34a低表達(dá)能夠抑制PDLCs細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其生長(zhǎng)，這一作用機(jī)制可能與降低STAT1蛋白表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]miR-34a;STAT1;牙周膜細(xì)胞;牙周炎;增殖;凋亡

[中圖分類號(hào)]R329.2+8? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）04-0115-04

Molecular Mechanisms of MiR-34a Targeting STAT1 Gene Regulating Proliferation and Apoptosis of Periodontal Ligament Cells

WU Xue，DUAN Shao-yu，LIANG Ping，LIU Xin

（Department of Stomatology，Beijing Electric Power Hospital，Beijing 100073，China）

Abstract： Objective? To investigate the molecular mechanism of the proliferation and apoptosis of periodontal ligament cells regulated by STAT1 gene targeting to miR-34a. Methods? Human periodontal ligament cells were isolated， cultured and diluted. According to Lipofectamine 2000 instructions， PDLCs were divided into three groups： Pm group， Py group and Pz group. Pz group （PDLCs were not treated with any treatment）， Pm group （transfected mimic of miR-34a）， Py group （transfected microarray）. miR-34a inhibitor， transfected for about 4 hours， discarded the upper liquid， replaced the medium， cultured for 48 hours. RT-PCR was used to detect the levels of STAT1 and miR-34a. Western blot was used to detect the expression of STAT1. Flow cytometry and MTT were used to detect the apoptosis and proliferation of PDLCs. Results? RT-PCR detection of STAT1 and miR-34a levels showed that compared with Pz group， STAT1 and miR-34a levels in Py group decreased significantly. STAT1 and miR-34a levels in Pm group were the highest， followed by STAT1 and miR-34a levels in Pz group， and STAT1 and miR-34a levels in Py group were the lowest （P<0.05）. Western blot analysis of STAT1 protein showed that compared with Pz group， the expression of STAT1 protein in Py group was significantly lower than that in Pm group. The expression of STAT1 protein in Pm group was the highest， followed by that in Pz group， and the expression of STAT1 protein in Py group was the lowest （P<0.05）. Flow cytometry showed that compared with Pz group， the apoptosis of PDLCs in Pm group increased significantly， and decreased significantly in Py group （P<0.05）. The apoptosis of PDLCs in Pm group was the highest in three groups， followed by Pz group and the lowest in Py group. MTT results showed that PDLCs in Pz group grew slowly at 24h， 48h and 72h. PDLCs? in Py group increased steadily at 24h and 48h， and increased significantly at 72h. The number of PDLCs in Pm group increased slowly under the influence of miR-34a （P<0.05）. Conclusion? The low expression of miR-34a can inhibit PDLCs cell apoptosis and promote its growth. This mechanism may be related to the reduction of STAT1 protein expression.

Key words： miR-34a; STAT1; periodontal ligament cells; periodontitis; proliferation; apoptosis

牙周炎是牙周組織發(fā)生慢性炎癥病變，患者可能會(huì)出現(xiàn)牙齦出血、牙槽骨破壞和牙周袋等癥狀，隨著病情的發(fā)展還會(huì)發(fā)展為牙齒松動(dòng)和脫落，是現(xiàn)在成年人牙齒缺失的主要原因[1]。牙周炎是常見的口腔疾病，研究表明，牙周膜細(xì)胞（PDLCs）生長(zhǎng)失衡是導(dǎo)致牙周炎出現(xiàn)的主要原因[2]，PDLCs細(xì)胞凋亡會(huì)引起其他疾病，嚴(yán)重威脅人們的身體健康[3]。近些年研究發(fā)現(xiàn)牙周炎中的致病菌主要對(duì)患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)起作用，PDLCs細(xì)胞作為牙周支持組織必不可少的一部分，具有效應(yīng)性，會(huì)受到炎性因子影響增長(zhǎng)受限或過剩，牙體出現(xiàn)疾病也與PDLCs細(xì)胞有關(guān)[4-5]。miR-34a是微小RNA之一，有相關(guān)研究證明，miR-34a會(huì)激活惡性生物活性和惡性特質(zhì)，加重疾病進(jìn)程，PDLCs細(xì)胞在維持牙周功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)有重要作用，在牙周炎組織中miR-34a表達(dá)水平上升，PDLCs凋亡細(xì)胞明顯增加，而當(dāng)miR-34a水平下降時(shí)，能有效改善牙周組織的損傷，說明miR-34a與PDLCs凋亡程度呈正相關(guān)[6-7]。STAT1信號(hào)分布在機(jī)體多個(gè)組織細(xì)胞內(nèi)，多種因子參與和調(diào)控PDLCs細(xì)胞分化，抑制STAT1信號(hào)表達(dá)可以明顯減少PDLCs細(xì)胞凋亡，說明STAT1信號(hào)在牙周炎發(fā)展過程中起重要作用[8]。由此，本文研究通過建立實(shí)驗(yàn)分組，探討miR-34a靶向STAT1基因調(diào)控PDLCs細(xì)胞增殖及凋亡的分子機(jī)制。

1? 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：RT-PCR試劑盒（上海Superchip technology），Trizol試劑（浙江AMEKO），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（武漢 賽維爾），RT-PCR試劑盒（上海 優(yōu)予），miR-34a-mimics、miR-34a-inhibitions（上海 吉瑪），無齲壞牙體組織。

1.2 人PDLCs細(xì)胞分離：生理鹽水清洗牙體組織，放入10%胎牛血清的α-MEM培育液再次清洗，刮取下根部組織剪碎，加入消化液混勻，放置在準(zhǔn)備好的培養(yǎng)箱中靜置12～14h，37℃下培養(yǎng)，消化后取出移至EP管中，經(jīng)800r/min離心后棄去上清，移入培養(yǎng)箱中加入1ml培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)傳代：初次接種細(xì)胞呈圓形，懸浮狀態(tài)，1d后逐漸貼壁，2d后貼壁細(xì)胞呈梭形或多邊形，7d后細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80%～90%，傳代培養(yǎng)棄去培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化，用吸管進(jìn)行吹打，制作細(xì)胞懸液，移植新培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)收集第5代細(xì)胞，將PDLCs細(xì)胞稀釋至1×105/ml，平鋪到16孔板中，待PDLCs細(xì)胞密度生長(zhǎng)為60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組：將稀釋的PDLCs細(xì)胞加入培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine 2000說明書操作進(jìn)行，將PDLCs細(xì)胞分成Pm、Py、Pz三組，Pz組（PDLCs細(xì)胞不做任何處理），Pm組（轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物）、Py組（轉(zhuǎn)染miR-34a抑制物），轉(zhuǎn)染4h左右，棄去上層液體，更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h。

1.5 RT-PCR檢測(cè)STAT1、miR-34a水平：PDLCs細(xì)胞總RNA運(yùn)用Trizol法進(jìn)行提取，總RNA提取反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對(duì)STAT1、miR-34a表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)參采用β-actin、60℃、10min，95℃、72℃、各30s，95℃、5min，循環(huán)次數(shù)以40為準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)至少3次。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入氯仿，搖蕩，離心，4℃ 1 200轉(zhuǎn)離心，加異丙醇、75%乙醇，離心，干燥，-80℃保存。總RNA提取反轉(zhuǎn)錄成cDNA，內(nèi)參采用U6，65℃，15min、95℃、72℃，各45s、95℃，15min，以40次為準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)至少3次。用相對(duì)定量2-ΔΔCT計(jì)算STAT1、miR-34a表達(dá)。

1.6 Westernblot法檢測(cè)STAT1蛋白表達(dá)：在6孔板中加入100μg的胰蛋白酶提取液，再注入2ml的培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞放入EP管中，并與胰蛋白酶提取液按照1：100進(jìn)行混合，再放入冰箱中冷凍10min，使細(xì)胞完全裂變，成為E溶液;在EP管中按照1：100比例加入胰蛋白酶提取液2ml，使細(xì)胞完全裂變成為F溶液，把E和F溶液以80：1的體積進(jìn)行搖勻，配制成工作液，放入37.5℃的保溫箱中20min，冷卻后計(jì)算STAT1蛋白濃度。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PDLCs細(xì)胞凋亡程度：用PBS溶液洗滌轉(zhuǎn)染2d后的細(xì)胞2次，離心5min，重懸細(xì)胞在100μl結(jié)合緩沖液中進(jìn)行，用5μl標(biāo)記FITC的AnnexinⅤ與5μl PI染色混勻，避光孵育15min后加入400μl結(jié)合緩沖液混勻，洗滌3次對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 MTT檢測(cè)PDLCs細(xì)胞增殖能力：PDLCs細(xì)胞離心轉(zhuǎn)染3～5min，在96孔板中接種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，每孔200μl，室溫37℃，5% CO2，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)不少于24h，不大于72h，加入MTT培養(yǎng)不少于3h，不大于4h，加入150μl的DMSO混勻，測(cè)光密度用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定（OD490nm），對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS 19.0軟件對(duì)STAT1、miR-34a水平變化、STAT1蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖調(diào)亡情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)算出的結(jié)果，組間兩兩比對(duì)，用χ2或t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 STAT1、miR-34a水平變化：RT-PCR檢測(cè)STAT1、miR-34a水平結(jié)果顯示，與Pz組比對(duì)，Py組STAT1、miR-34a水平有顯著下降，Pm組STAT1、miR-34a水平最高，Pz組STAT1、miR-34a水平其次，Py組STAT1、miR-34a水平最低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。

2.2 STAT1蛋白變化情況：Western blot法檢測(cè)STAT1蛋白發(fā)現(xiàn)，Pz、Pm、Py三組細(xì)胞STAT1蛋白表達(dá)量分別為1.06±0.23、1.51±0.48、0.74±0.13，與Pz組比對(duì)，Py組STAT1蛋白較Pm組有顯著下降，Pm組STAT1蛋白表達(dá)最高，Pz組蛋白表達(dá)其次，Py組STAT1蛋白表達(dá)最低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。

2.3 PDLCs細(xì)胞調(diào)亡情況：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Pz組相比，Pm組PDLCs細(xì)胞凋亡明顯增加，Py組細(xì)胞凋亡明顯降低，Pm組細(xì)胞凋亡呈三組最高，Pz組其次，Py組最低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。

2.4 MTT檢測(cè)PDLCs細(xì)胞增殖能力：MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：Pz組PDLCs細(xì)胞在24h、48h、72h時(shí)均緩慢增長(zhǎng)，Py組PDLCs細(xì)胞24h、48h增殖變化較平穩(wěn)，72h時(shí)增殖速度明顯加快，Pm組受miR-34a模擬物影響，PDLCs細(xì)胞數(shù)量增殖緩慢（均P<0.05）。

3? 討論

牙周炎是一種口腔科的慢性疾病，主要表現(xiàn)在牙齦炎癥和牙槽骨病理性吸收，引起牙周炎的原因有很多種，例如：牙周膜細(xì)胞分化異常，免疫疾病和遺傳等因素[9]。有大數(shù)據(jù)表明，我國(guó)有90%以上的人群都患有牙齦炎癥，臨床上表現(xiàn)為患者咀嚼功能降低，牙周炎的發(fā)生也有可能與患者的心血管疾病和糖尿病緊密相關(guān)，對(duì)人們的生活造成嚴(yán)重不便[10]。研究表明牙周炎患者體內(nèi)STAT1水平出現(xiàn)失衡，宿主免疫、PDLCs細(xì)胞功能受到損傷，這些原因已經(jīng)成為許多學(xué)者研究牙周炎機(jī)制的重點(diǎn)[11]。miR-34a廣泛存在于哺乳動(dòng)物中，具有組織特異性，同樣廣泛存在人體組織中，參與組織細(xì)胞的生長(zhǎng)，但在一定程度上會(huì)抑制正常細(xì)胞的再生，甚至?xí)铀俅龠M(jìn)PDLCs細(xì)胞的凋亡[12]。

通過觀察STAT1、miR-34a水平，STAT1蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與Pz組比對(duì)，Py組STAT1、miR-34a水平有顯著下降，Pm組STAT1、miR-34a水平最高，Pz組STAT1、miR-34a水平其次，Py組STAT1、miR-34a水平最低。與Pz組比對(duì)，Py組STAT1蛋白較Pm組有顯著下降，Pm組STAT1蛋白表達(dá)最高，Pz組蛋白表達(dá)其次，Py組STAT1蛋白表達(dá)最低。有研究證實(shí)，miR-34b和miR-34c都能對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和調(diào)控以及纖維化產(chǎn)生影響，近些年來，與牙周炎相關(guān)的miRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，miR-34a在牙周膜細(xì)胞分化過程中的調(diào)控機(jī)制也逐漸被證實(shí)[13-14]。有研究證實(shí)，STAT1近年來被發(fā)現(xiàn)成為與細(xì)胞組織分化密切相關(guān)的信號(hào)通路分子[15]。STAT3是屬于STAT家族中的轉(zhuǎn)錄活化因子蛋白，當(dāng)STAT3發(fā)生磷酸化的時(shí)候形成二聚體，并轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核與染色體上靶基因啟動(dòng)子進(jìn)行結(jié)合，誘導(dǎo)位于其下游的基因即靶基因轉(zhuǎn)錄激活。同時(shí)磷酸化的STAT3可以調(diào)控細(xì)胞G1/S期及G2/M期的調(diào)控因子使細(xì)胞生存周期延長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變。有研究發(fā)現(xiàn)miR-34a通過PI3K/Akt/Bad途徑靶向GAS1促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖和抑制凋亡，而PI3K/AKT/mTOR抑制劑能反饋激活STAT3激酶活性，因此，推測(cè)MiR-34a調(diào)控STAT3蛋白可能與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)[16-17]。

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Pz組比對(duì)，Pm組PDLCs細(xì)胞凋亡明顯增加，Py組細(xì)胞凋亡明顯降低，Pm組細(xì)胞凋亡呈三組最高，Pz組其次，Py組最低。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：Pz組PDLCs細(xì)胞在24h、48h、72h時(shí)均緩慢增長(zhǎng)，Py組PDLCs細(xì)胞24h、48h增殖變化較平穩(wěn)，72h時(shí)增殖速度明顯加快，Pm組受miR-34a模擬物影響，PDLCs細(xì)胞數(shù)量增殖緩慢。本實(shí)驗(yàn)在預(yù)測(cè)可能調(diào)控STAT1信號(hào)通路的miRNA中發(fā)現(xiàn)有miR-34a的結(jié)合位點(diǎn)，用MTT與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)得出，STAT1的基因活性受到miR-34a的影響可以對(duì)其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[18-19]。同樣證實(shí)，miR-34a的表達(dá)量上升，細(xì)胞再生過程中STAT1可能起到抑制作用。而有研究表明，STAT1是miR-34a的靶基因，STAT1與PDLCs細(xì)胞的增殖和凋亡有密切關(guān)系[20]。另研究發(fā)現(xiàn)，STAT1對(duì)PDLCs細(xì)胞起關(guān)鍵性作用。miR-34a和STAT1二者在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[21]。這與本文的研究結(jié)果一致。Xue Jin研究證實(shí)，促進(jìn)PDLCs細(xì)胞分化可通過下調(diào)miR-34a的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，讓PDLCs細(xì)胞恢復(fù)功能活性，這說明miR-34a可以有效反映PDLCs細(xì)胞凋亡水平[22]，這與本文研究相符。

綜上所述，miR-34a低表達(dá)能夠抑制PDLCs細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其生長(zhǎng)，這一作用機(jī)制可能與降低STAT1蛋白表達(dá)有關(guān)。

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[收稿日期]2019-10-21

本文引用格式：吳雪，段少宇，梁萍，等.miR-34a靶向STAT1基因調(diào)控牙周膜細(xì)胞增殖及凋亡的分子機(jī)制[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2021，30（4）： 115-118.