俞佳妮,賈巧君,葉子弘,楊東風(fēng),侯卓妮,肖 藝,張曉丹

(1.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院 浙江省植物次生代謝調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310018;2.中國(guó)計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018;3.寧波易中禾藥用植物研究院有限公司,浙江 寧波 315122)

二氫丹參酮Ⅰ,作為丹參有效物質(zhì)丹參酮類物質(zhì)的重要組分,在抗炎、抗癌[1-4]、抗腫瘤、心血管防治等方面均具有顯著療效[5-6],是檢驗(yàn)丹參藥效的重要指標(biāo)成分之一。近年來對(duì)于中藥指紋圖譜的研究逐漸受到矚目,作為丹參有效成分之一的二氫丹參酮Ⅰ是作為丹參質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo),在研究中常需要測(cè)定其含量[7-9]。然而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品研制方法的報(bào)道較少,且市面上無(wú)可購(gòu)買的二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品,由于其標(biāo)準(zhǔn)樣品的缺乏,不僅制約了二氫丹參酮Ⅰ的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,也限制了國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)二氫丹參酮Ⅰ藥理藥效的進(jìn)一步研究與二氫丹參酮Ⅰ產(chǎn)品的開發(fā)。因此全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)樣品技術(shù)委員會(huì)批準(zhǔn)了二氫丹參酮Ⅰ國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制。本文以ISO Guide 35:2017作為參照,依據(jù)GB/T 15000.3—2008標(biāo)準(zhǔn)樣品系列工作導(dǎo)則[8],研制了二氫丹參酮Ⅰ的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi Rotavapor R-3)、冷凍干燥儀(Scientz-12N)、液相色譜儀(Waters e2695)、中壓制備液相色譜儀(Buchi Pure C-815)、Waters快速純化制備色譜(Waters Prep 150 LC System)、傅里葉紅外光譜分析儀FT-IR(Necolit iS5)、紫外吸收?qǐng)D譜分析儀(UV-2500PC series)、HYG-B恒溫?fù)u床(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)儀器廠)、AB204-N電子天平(瑞士梅特勒公司)、乙酸乙酯和石油醚等分析純?cè)噭?杭州常青化工有限公司),以及乙腈、甲醇、乙醇(色譜純,Merck公司),200～300目硅膠(青島海洋化工廠)和GF254硅膠板(山東煙臺(tái)匯友硅膠有限公司)。

1.2 二氫丹參酮Ⅰ樣品的制備

原料為采集于丹參道地產(chǎn)區(qū)陜西商洛丹參(SalviaMiltiorrhiza)的根(根為紅色),將其粉碎后經(jīng)乙醇溶劑回流提取3次,2～5 ℃靜置析晶后抽濾得總丹參酮粗品。采用正相硅膠柱層析進(jìn)一步純化樣品,以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫,合并收集二氫丹參酮Ⅰ斑點(diǎn)段。濃縮干燥后利用中壓液相色譜進(jìn)行第二次純化,以乙腈-去離子水梯度洗脫,最后用甲醇洗脫,經(jīng)薄層層析檢測(cè)后根據(jù)Rf值合并相同組分進(jìn)行真空濃縮,得到純度為90%的二氫丹參酮Ⅰ粗品。將上述粗品繼續(xù)采用Waters快速純化制備色譜,以乙腈-去離子水梯度洗脫,經(jīng)薄層層析檢測(cè)后根據(jù)Rf值合并相同組分進(jìn)行真空濃縮,經(jīng)過2次重結(jié)晶(結(jié)晶溶劑為二氯甲烷-甲醚),過濾結(jié)晶,冷凍干燥后得到純度高于99%的二氫丹參酮Ⅰ樣品。制備過程中二氫丹參酮Ⅰ純品純度確認(rèn)采用TLC分析與HPLC檢測(cè)。

1.3 分裝與儲(chǔ)存

在相對(duì)清潔且獨(dú)立的環(huán)境中,用電子天平精確稱量,分別將100份10 mg二氫丹參酮Ⅰ樣品裝入100個(gè)4 mL的棕色小瓶中,并且以1到100進(jìn)行編號(hào),密封后于4 ℃保存。

1.4 雜質(zhì)分析

采用庫(kù)倫電位滴定法:瑞士萬(wàn)通KF915水分測(cè)定儀,卡爾費(fèi)休試劑滴定,以純水標(biāo)定所制備的二氫丹參酮Ⅰ樣品水分。采用EXPEC 7000型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定二氫丹參酮Ⅰ樣品無(wú)機(jī)雜質(zhì)。為測(cè)定無(wú)機(jī)雜質(zhì),準(zhǔn)確稱取5.32 mg樣品,溶于20 mL甲醇,完全溶解后,定容至50 mL容量瓶,搖勻待測(cè)。用校準(zhǔn)液進(jìn)行半定量曲線校準(zhǔn),建立半定量工作曲線,以質(zhì)量數(shù)為橫坐標(biāo),半定量因子為縱坐標(biāo),建立校準(zhǔn)曲線,分析樣品。

1.5 定性分析

采用熔點(diǎn)與元素分析樣品水分與灰分。紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)、核磁共振(NMR)進(jìn)行定性分析,對(duì)制備的樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn),分析條件如下。

紫外光譜(UV):溶劑為乙醇,紫外可見光區(qū)(200～600 nm)全波長(zhǎng)掃描。

紅外光譜(IR):溴化鉀壓片后對(duì)吸收峰進(jìn)行分析。

液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS):儀器為布魯克microTOF-Q,質(zhì)譜條件為電離方式ESI+,毛細(xì)管電壓4.5 kV,載氣用普氮,載氣流速為4.0 L/min,載氣溫度180 ℃,掃描范圍為m/z=50～800。

核磁共振(NMR):以氘代丙酮為溶劑,四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.6 均勻性檢驗(yàn)

均勻性是用于衡量標(biāo)準(zhǔn)樣品空間分布特征的基本屬性。對(duì)于二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品來說,具有一定規(guī)格的標(biāo)準(zhǔn)樣品,在同一批次或同一瓶?jī)?nèi)的樣品的二氫丹參酮Ⅰ的純度都應(yīng)是均勻的,在檢測(cè)時(shí)其定值應(yīng)在規(guī)定的不確定范圍內(nèi),該標(biāo)準(zhǔn)樣品才能被定義為均勻的。

為了對(duì)所制備的二氫丹參酮Ⅰ樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn),首先需要對(duì)所制備的同一批樣品進(jìn)行分裝,抽樣標(biāo)準(zhǔn)按標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則[10]中對(duì)均勻性研究的要求進(jìn)行。抽樣數(shù)目確定為10個(gè),取10瓶樣品并以1～10進(jìn)行編號(hào),從10瓶樣品中以3種不同程序從上述編號(hào)的樣品分別各稱取0.25 mg樣品3份,并以1.0 ml色譜乙醇作為溶劑溶解后進(jìn)行HPLC分析,樣品純度值以HPLC面積歸一法進(jìn)行測(cè)定。HPLC條件為:儀器用Waters e2695型高效液相色譜儀。色譜柱為Sunfire-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動(dòng)相是乙腈/(0.2%乙酸)水=50/50。流速1.0 mL/min。柱溫30 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。進(jìn)樣量10 μL。

3次的抽樣樣品編號(hào)順序?yàn)?,3,5,7,9,2,4,6,8,10號(hào)瓶;10,9,8,7,6,5,4,3,2,1號(hào)瓶;2,4,6,8,10,1,3,5,7,9號(hào)瓶。對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性情況通過對(duì)測(cè)得數(shù)據(jù)使用方差分析法來判斷。

1.7 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性是用來描述標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值隨時(shí)間的變化。本文設(shè)置了實(shí)驗(yàn)將所制備樣品在0～4 ℃條件下放置24個(gè)月來檢驗(yàn)其穩(wěn)定性,分別于0,1,2,3,6,9,12,18,24個(gè)月時(shí)取3個(gè)樣品,按照1.6項(xiàng)下色譜條件,每份試樣以測(cè)定3次的平均值為其定值結(jié)果,用峰面積歸一化法計(jì)算純度。

1.8 定值分析

1.8.1 定值分析方法

根據(jù)GB/T 15000—2008規(guī)定,對(duì)所制備樣品的定值需由多個(gè)權(quán)威實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行聯(lián)合定制分析,所選實(shí)驗(yàn)室需要獲得國(guó)家或部門認(rèn)可的具備資質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)選取共8個(gè)具備資質(zhì)的權(quán)威實(shí)驗(yàn)室,從所制備樣品中隨機(jī)抽取24瓶,隨機(jī)送3瓶去往各實(shí)驗(yàn)室,每瓶樣品進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定2次。送去的樣品在各定值實(shí)驗(yàn)室使用高效液相色譜儀測(cè)定其純度,并采用HPLC面積歸一化法對(duì)純度進(jìn)行定值,色譜條件與1.6項(xiàng)下一致,并將檢測(cè)報(bào)告從各實(shí)驗(yàn)室收集起來進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.8.2 樣品溶液制備

本實(shí)驗(yàn)室以色譜乙醇溶解樣品,過0.22 μm微孔濾膜,獲得質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 二氫丹參酮Ⅰ的雜質(zhì)分析

2.2 二氫丹參酮Ⅰ的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 熔點(diǎn)和元素分析

使用儀器為梅特勒熔點(diǎn)儀MP50,其測(cè)得所制備樣品的熔點(diǎn)為216～217 ℃。根據(jù)JY/T 017—1996元素分析儀方法通則進(jìn)行測(cè)試,平行測(cè)試三次。根據(jù)元素分析結(jié)果可得所制備樣品的分子式為C18H14O3,計(jì)算值:C 77.69%,H 5.036%。實(shí)際測(cè)定值:C(77.68±0.007)%,H(5.062±0.005)%。

2.2.2 紫外(UV)光譜分析

掃描結(jié)果為在410.40 nm,290.40 nm,240.80 nm,215.20 nm處有吸收。

2.2.3 紅外(IR)光譜分析

2.2.4 液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)分析

ESI-MS模式下測(cè)量值m/z=301.083 9[M+Na]+,理論計(jì)算值m/z=301.083 5[M+Na]+,測(cè)得二氫丹參酮Ⅰ分子量為278.30,分子式為C18H14O3。

2.2.5 核磁共振(NMR)分析

核磁數(shù)據(jù)歸屬見表1與表2。

表1 二氫丹參酮Ⅰ的氫譜核磁共振數(shù)據(jù)(600 MHz,氘代丙酮)

表2 二氫丹參酮Ⅰ的碳譜核磁共振數(shù)據(jù)(150 MHz,acetone-d6)

由上述液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果與核磁共振分析結(jié)果與已發(fā)表文獻(xiàn)對(duì)比可知,所制備樣品種化合物的HPLC-MS和NMR數(shù)據(jù)均與二氫丹參酮Ⅰ結(jié)構(gòu)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道一致[11-12],證明該化合物確為二氫丹參酮Ⅰ,結(jié)構(gòu)式見圖1。

治療前兩組患者NIHSS、3MS、BI評(píng)分比較無(wú)顯著性差異；治療后兩組患者NIHSS評(píng)分顯著降低，3MS、BI評(píng)分均顯著升高，同組治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后觀察組患者NIHSS、3MS、BI評(píng)分改善情況均顯著優(yōu)于對(duì)照組，兩組比較存在顯著性差異（P＜0.05），見表2。

圖1 二氫丹參酮Ⅰ結(jié)構(gòu)式Figure 1 Chemical structure of dihydrotanshinone Ⅰ

2.3 均勻性試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性性檢驗(yàn)是標(biāo)準(zhǔn)樣品研制過程中不可缺少的程序。因此在對(duì)樣品進(jìn)行分裝后,對(duì)二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行純度均勻性檢驗(yàn),均勻性檢驗(yàn)結(jié)果見表3與表4。

表3 二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品純度均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

從上表4可見,以υ1(即組間)=9及υ2(即組內(nèi))=20,F=MS間/MS內(nèi)=1.52

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

0,1,2,3,6,9,12,18,24個(gè)月樣品純度統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果

從表5可見,在24個(gè)月中,不同時(shí)間測(cè)得的樣品純度平均值并在沒有隨時(shí)間的變化而明顯的改變,同時(shí)根據(jù)GB/T 15000—2008中對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性分析的要求,選取直線模型作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?采用F檢驗(yàn)與t檢驗(yàn)對(duì)不同時(shí)間測(cè)得的樣品純度平均值數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,分析過程如下。

t檢驗(yàn)斜率計(jì)算:

|b1|

因此,斜率的變化是不顯著的。因而二氫丹參酮Ⅰ樣品在兩年內(nèi)未觀測(cè)到顯著的不穩(wěn)定性。有效期t=24個(gè)月的長(zhǎng)期穩(wěn)定性的不確定度的貢獻(xiàn)為u=sb·t=0.002 003×24=0.048 072。

因此可以確定在0～4 ℃的儲(chǔ)存條件下,所制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品在24個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.5 定值結(jié)果及其不確定度評(píng)定

2.5.1 定值結(jié)果

二氫丹參酮Ⅰ純度定值結(jié)果匯總表如表6。

表6 8家實(shí)驗(yàn)室二氫丹參酮Ⅰ純度定值數(shù)據(jù)

表7 8家實(shí)驗(yàn)室定值數(shù)據(jù)方差分析

2.5.2 定值分析的不確定度評(píng)定

根據(jù)GB/T 15000.3—2008標(biāo)準(zhǔn)可知,定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度組成。標(biāo)準(zhǔn)值定值實(shí)驗(yàn)引入的不確定度uchar、均勻性檢驗(yàn)引入的不確定度ubb和穩(wěn)定性檢驗(yàn)引入的不確定度ults組成了標(biāo)準(zhǔn)樣品特性標(biāo)準(zhǔn)值的測(cè)量不確定度u。依據(jù)全部測(cè)定結(jié)果,計(jì)算二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品的不確定度。

由上述分析結(jié)果可知,本文所制備二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品的不確定度由uchar=0.062 5%,ubb=0.013 128%,ults=0.048 072%,此外還有雜質(zhì)檢驗(yàn)中水分引入的不確定度u水分=0.230 77%,灰分引入的不確定度u灰分=0.029 557組成。

則其擴(kuò)展不確定度為

因此二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果為:二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品的純度為99.835%。二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品擴(kuò)展不確定度按只進(jìn)不舍原則處理并統(tǒng)一小數(shù)點(diǎn)位數(shù)后為0.50%。

3 結(jié) 語(yǔ)

本文以標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則作為參照,研制了二氫丹參酮Ⅰ的標(biāo)準(zhǔn)樣品。經(jīng)檢驗(yàn),所研制的二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性與穩(wěn)定性均符合國(guó)家對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求,所制備的樣品的純度定值結(jié)果為(99.835±0.50)%,達(dá)到了天然產(chǎn)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求。該標(biāo)準(zhǔn)樣品可用于丹參等藥材中的二氫丹參酮Ⅰ含量的測(cè)定,有利于對(duì)丹參產(chǎn)業(yè)的質(zhì)量控制,與進(jìn)一步的藥效研究。同時(shí)也可用于一些抗衰老護(hù)膚產(chǎn)品的開發(fā)研制。