楊 超，梁璋成，林曉姿，蘇 昊，何志剛 ，郭京波 ，李維新

（1. 山西師范大學食品科學學院，山西 臨汾 041000；2. 福建省農業(yè)科學院農業(yè)工程技術研究所，福建 福州 350003；3. 福建省農產品（食品）加工重點實驗室，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）又名江蘺、鳳菜等，屬于紅藻門、杉藻目、江籬屬，是一種紅藻類海洋植物[1]，在我國山東、浙江、福建、廣東等地[2,3]的沿海海域大量栽培生產，成為繼紫菜、海帶、裙帶菜之后的第四大養(yǎng)殖海藻。其富含海藻多糖、維生素、蛋白質以及磷、鈣、碘、鐵、鋅、鎂等多種礦物質以及多種人體必需的微量元素和活性物質，具有較高的保健和營養(yǎng)價值[4]。但因為龍須菜腥味大、適口性差，目前主要用于提取瓊脂及作為鮑魚等飼料開發(fā)，其深度開發(fā)利用受到制約，大量龍須菜資源未能得到充分的利用[5]?！厩叭搜芯窟M展】目前主要的脫腥方法有物理脫腥、化學脫腥、生物脫腥等[6]。其中，物理脫腥是通過采用香辛料、β-環(huán)糊精對腥味物質進行掩蓋、包埋等，并沒有從根本上去除掉這些腥味成分，脫腥效果差；化學脫腥利用一些化學試劑與腥味物質發(fā)生化學反應達到除腥的目的，但化學試劑的添加可能會對其他物質的結構造成破壞；生物脫腥利用食品微生物或酶技術對原料進行發(fā)酵脫腥，由菌種及其產生的酶類分解或代謝基質中的腥味物質，并形成特殊的風味物質[7]。因此生物脫腥不僅可實現海藻脫腥、改善風味，甚至有可能使活性物質增加或強化[8]。微生物發(fā)酵脫腥技術在魚類、貝類脫除腥味成分方面[9－11]的應用取得了良好成效，但不同原料適宜的發(fā)酵微生物菌種及其工藝不盡相同。如馬浩田等[12]用酵母菌發(fā)酵鯰魚，在接種量1.0%，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時間90 min條件下，脫腥效果最好；Seo等[13]采用米曲霉發(fā)酵海帶，在轉速120 r·min－1、30 ℃條件下發(fā)酵4 d的海帶腥味物質成分下降，與發(fā)酵前相比，腥味強度下降了4倍?！颈狙芯壳腥朦c】迄今鮮見生物脫腥在龍須菜中應用的報道。頂空固相微萃取-氣相色譜質譜（HS-SPME-GC-MS）可定性、定量檢測非氣態(tài)物質里的揮發(fā)性氣體成分，在檢測揮發(fā)性風味物質方面應用廣泛[14－16]，可用于檢測龍須菜生物脫腥后風味物質的變化?！緮M解決的關鍵問題】本試驗以經濟型海藻龍須菜為研究對象，通過感觀模糊評判篩選出生物脫腥微生物菌種組合，優(yōu)化發(fā)酵基料營養(yǎng)成分配比、菌種組合比例及接種量及發(fā)酵工藝參數，應用HS-SPME-GC/MS技術解析發(fā)酵前后龍須菜揮發(fā)性風味物質的變化，為龍須菜深加工、提 升其高附加值提供重要支持。

1 材料與方法

1.1 原料與主要試劑

原料：龍須菜（鮮品）由福建省寧德市三都鎮(zhèn)基地采收，當天運回實驗室于－20 ℃保存?zhèn)溆?；白砂糖、蘋果酸（食品級）、甘蔗糖蜜，市購。

菌種：植物乳桿菌（L.plantarum）R23、副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei）RP38和 釀 酒 酵 母 （Saccharomyces cerevisia）JJ4，由福建省農產品（食品）加工重點實驗 室分離、鑒定并保存。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；BC/BD-217CH冷柜，河南新飛電器有限公司；BS110S電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；TGL16M臺式高速冷凍離心機，上海諾頂儀器設備有限公司；LRH-160生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津科技有限公司；色譜柱為DB-5毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），SPME手動進樣手柄及固定搭載裝置50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，安捷倫科技有限公司；20 mL頂空進樣 瓶，美國Supelco公司

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備 糖蜜培養(yǎng)基制備：將甘蔗糖蜜稀釋至可溶性固形物至質量分數為5%，用檸檬酸調節(jié)pH至5.0±0.2，115 ℃高壓滅菌30 min，用于酵母菌液體培養(yǎng)。

LH18培養(yǎng)基[17]：蛋白胨15 g·L－1，牛肉膏10 g·L－1，葡萄糖30 g·L－1，酵母膏7.4 g·L－1，檸檬酸銨2 g·L－1，硫酸鎂0.36 g·L－1，硫酸錳0.05 g·L－1，吐溫－80 1 g·L－1，番茄汁100 mL·L－1，蘋果酸鈉20 g·L－1，調整pH至4.8±0.2，121 ℃高壓滅菌20 min，用于乳酸菌培養(yǎng)。

1.3.2 種子液制備 供試乳酸菌和酵母菌經活化后，分別接種于LH18培養(yǎng)基和糖蜜培養(yǎng)基中擴培至菌量達109cfu·mL－1和108cfu·mL－1，采用4 800 r·min－1、4 ℃離 心10 min，取菌坭加等體積無菌水振蕩懸浮，待用。1.3.3 脫腥菌種篩選 龍須菜洗凈瀝干，長度切至大約3 mm，待用。取30 g龍須菜，按m（龍須菜）∶m（蒸餾水）=1∶2的比例置于150 mL的三角瓶中，添加2%（m/m）白砂糖、0.2%（m/m）蘋果酸，水浴滅菌（100 ℃ 10 min）。冷卻后按表1方案接種，每組處理重復3次，每組接種量各為5%（復合菌種按1∶1的比例接種），30 ℃發(fā)酵3 d。采用感官模糊綜合評價對比分析確定適宜菌種。

表1 菌種接種方案Table 1 Bacteria inoculation program

1.3.4 脫腥工藝單因素試驗 取30 g龍須菜，按m（龍須菜）∶m（蒸餾水）=1∶2的比例置于150 mL的三角瓶中，調整糖、酸后，100 ℃水浴滅菌10 min，冷卻后接種發(fā)酵。各單因素設定為白砂糖添加量（m/m）為1%、2%、3%、4%、5%，蘋果酸添加量（m/m）為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，接種量1%、3%、5%、7%、9%、發(fā)酵溫度21、24、27、30、33 ℃、發(fā)酵時間1、2、3、4、5 d。固定處理參數為糖添加量2%，蘋果酸添加量0.2%，菌接種量各5%，發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間3 d。感官模糊綜合評價法評價脫腥效果，每次試驗處理重復3次，取 平均值。

1.3.5 Box-Behnken響應面試驗設計 根據單因素試驗結果，選擇菌種添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等3個因素作為自變量，以感官評價為響應值，對脫腥工藝進行響應面試驗設計，因素與水平見表2。

表2 響應面試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experimental design

1.3.6 龍須菜揮發(fā)性風味物質分析 參照顧賽麒等[18－19]方法，略有修改。取龍須菜樣品5 g置于20 mL的頂空進樣瓶中進行萃取。萃取條件：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭老化溫度250 ℃；老化時間15 min；平衡溫度60 ℃；平衡時間30 min；250 ℃解吸附3 min，用于GC-MS分析。

GC條件：DB-5MS（30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）；采用程序升溫方式，起始溫度50 ℃，保持3 min，以10 ℃·min－1的 速 率 上 升 至90 ℃，保 持5 min，以10 ℃·min－1的速率上升至230 ℃，保持2 min；以20 ℃·min－1的速率上升至280 ℃，保持5 min；載 氣 為He，流 速1.0 mL·min－1；不 分 流 進樣。MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質量掃描為m/z 35～550；發(fā)射電流100 μA。

氣相色譜-質譜聯用儀數據通過檢索NIST2014譜庫，選擇RTE積分器進行積分，并通過選擇質量數大于80的化合物，結合保留指數RI實現定性分析?？鄢V圖中的硅氧烷類雜峰及其他非嗅感物質雜峰，計算揮發(fā)性風味物質的總峰面積，采用面積歸一化法計算各化合物的相對含量[20]。其中計算各揮發(fā)性組分的RI（保留指數），公式：RI=100n+100（txtn）/（tn+1－tn），其中tx、tn、tn+1分別為被分析組分和碳原子處于n和n+1之間的正構烷烴流出峰的保留 時間。

1.3.7 感官模糊綜合評價

1.3.7.1 感官得分綜合評判標準 組織13名接受過相關培訓的食品專業(yè)師生組成評定小組。采用層次分析法建立龍須菜的評價域U={腥味U1，香味U2，滋味U3，色澤U4}，設定各評價指標的模糊權向量A={0.35，0.35，0.25，0.05}，設定評價等級S＝{優(yōu)等S1，良好S2，合格S3，不合格S4}，品評標準見表3。選用M（－，+）算子建立模糊綜合評價模型，各等級的軼值標準見表4，每個樣品構成1個普通集合（論 域）：F={F1，F2，…，F19}，Fi{i＝1，2，…19}，Fi表示i種龍須菜樣品，根據隸屬度采用秩加權平均原則進行感官模糊綜合評價[21]。

表3 龍須菜感官評分標準Table 3 Sensory scoring criteria of Asparagus

表4 各等級的軼值Table 4 Proliferation value of each grade

計算公式如下：13名評價人員對樣品進行腥味、香味、滋味、色澤進行評價并歸一化處理，各等級評價人數分別除以總評價人數，得到各指標的模糊權向量：U1={a1，b1，c1，d1}，U2={a2，b2，c2，d2}，U3={a3，b3，c3，d3}，U4={a4，b4，c4，d4}。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 20.0軟件對數據進行單因素方差分析，用 Design Expert 8.0.6軟件進行響應面設計及分析。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選

由圖1可知，不同菌種發(fā)酵產生的風味不同，組合發(fā)酵效果優(yōu)于單一菌種發(fā)酵，以副干酪乳桿菌副干酪亞種RP38和釀酒酵母JJ4按1∶1組合發(fā)酵的去腥效果最佳，且具有較愉悅的發(fā)酵香氣和醇香，與其他處理的差異均達顯著水平（P＜0.05），將該組 合處理作為后續(xù)試驗的發(fā)酵菌。

圖1 不同菌種發(fā)酵對脫腥效果的影響Fig. 1 Influence of fermentation of different strains on theeffect of deodorization

2.2 發(fā)酵條件對龍須菜脫腥效果的影響

由圖2可知，當菌接種量為5%時，樣品的感官得分值最高，繼續(xù)增加接種量，其感官得分變化不顯著（P＞0.05），考慮到節(jié)約成本，確定適宜接種量為5%；白砂糖添加量為2%時，樣品感官得分最高，繼續(xù)增加糖添加量樣品感官得分不顯著（P＞0.05），考慮到節(jié)約成本選擇適宜的糖添加量為2.0%；蘋果酸添加量過高過低，樣品感官得分都較低，說明添加適量蘋果酸有利于發(fā)酵風味的提高，最適蘋果酸添加量為0.2%，與其他處理的差異均達顯著水平（P＜0.05）；發(fā)酵溫度對樣品的感官得分的影響呈先上升后下降趨勢，適宜的發(fā)酵溫度為30 ℃，與其他處理的差異均達顯著水平（P＜0.05）；發(fā)酵時間對樣品的感官得分的影響呈先上升后下降趨勢，發(fā)酵時間為3 d與1 、2 d處理的差異均達極顯著水平（P＜0.01），與4 、5 d差異不顯著（P＞0.05），因此選擇適宜的發(fā)酵時間為3 d。

圖2 發(fā)酵條件對脫腥效果的影響Fig. 2 Influence of fermentation conditions on the effect of deodorization

2.3 龍須菜生物脫腥工藝優(yōu)化

2.3.1 響應面設計與建模分析 為進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，在單因素試驗結果的基礎上，以菌種添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）為自變量，模糊綜合評價分值為響應值（Y），響應面試驗結果見表5、6。響應值與各因素之間的二次多項回歸方程為：

表5 響應面試驗設計與結果Table 5 Design matrix and experiment results of responsesurface method

結果表明，二次回歸模型差異極顯著（P＜0.01），失擬項差異不顯著（P＞0.05）,說明該模型適用于模擬響應值和各因素之間的關系，并且模型的相關系數R2=0.970 0，表明模型擬合度較好，可以采用該模型對龍須菜脫腥進行預判。3個因素對脫腥效果的影響程度大小為B＞C＞A，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞菌接種量。尋優(yōu)參數為：接種量5.1%，發(fā)酵時間68.3 h，發(fā)酵溫度28.7 ℃，在此條件下響應值為7 2.7分。

2.3.2 響應面交互作用分析 兩因素交互作用中，只有發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）的交互作用對感官評分影響顯著，因此固定接種量在零水平，繪制出兩因素交互作用響應面曲面分析圖和等高線分析圖（圖3）。當發(fā)酵時間一定時，發(fā)酵溫度低于29 ℃時響應值與發(fā)酵溫度呈正相關，高于29 ℃時響應值則與發(fā)酵溫度呈負相關；當發(fā)酵溫度一定時，發(fā)酵時間短于68 h時響應值與發(fā)酵時間呈正相關，長于68 h時響應值與發(fā)酵溫度呈負相關。在達到中心附

圖3 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間交互作用對感官評分的響應面和等高線Fig. 3 Tesponse surface and contour map of the interaction between fermentation temperature and fermentation time to sensory score

表6 二次回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance of quadratic regression model

2.3.3 最優(yōu)發(fā)酵工藝的驗證 為了驗證模型的可靠性，在最優(yōu)發(fā)酵脫腥條件下進行3次重復驗證試驗，所得到的響應值為（73.4±0.94）分，實測值與模擬預測值相對誤差為0.96%，差異不顯著（P＞0.05）。處理組的龍須菜無腥味，并具有愉悅的花果香等發(fā)酵 香且適口性強。

2.4 脫腥前后龍須菜中的揮發(fā)性風味成分變化

采用HS-SPME-GC/MS法對脫腥前后的龍須菜樣品進行揮發(fā)性風味解析，共檢出7大類54種成分，發(fā)酵前為36種，發(fā)酵后為37種，檢測結果見表7，發(fā)酵前后龍須菜的揮發(fā)性物質種類和相對含量的差異如圖4、5所示。烴類物質種類經過發(fā)酵由8種減為5種，總含量由17.45%降為5.96%，醇類物質種類經過發(fā)酵未變化，但總含量由6.91%升高為55.26%，脂肪味、腥臭味的環(huán)辛醇和1-甲基環(huán)庚醇發(fā)酵后消失，新檢出具有芳香味的β-苯乙醇、（E）-2,4,4,7-四甲基-5.7 -辛二烯-3-醇。醛類種類經過發(fā)酵由7種減為4種，總含量從14.87%降為2.32%，其中具有魚腥味的辛醛、脂肪味的正壬醛和（E）-2-壬烯醛發(fā)酵后未檢出。酮類種類經過發(fā)酵由6種降為3種，總含量從42.55%降為5.8%，有泥土腥味中的3-辛酮含量明顯降低，羥甲基呋喃酮、3-乙基-4-甲基-吡咯-2,5-二酮和2-十九烷酮發(fā)酵后未檢出。酸類種類經過發(fā)酵由6種減為5種，總含量從6.52%增加到7.85%，其中4-甲基辛酸在發(fā)酵后未檢出，癸酸相對含量增加。酯類種類經過發(fā)酵由5種增加為18種，總含量從4.88%上升到22.8%，新檢出了具有水果香的己酸乙酯、酒香的辛酸乙酯、甜蜜香的乙酸苯乙酯、椰子香氣的壬酸乙酯等13種物質，這些酯類物質可能

圖4 龍須菜揮發(fā)性物質相對含量對比Fig. 4 Comparison of relative content of volatile substances in GL

表7 龍須菜揮發(fā)性風味物質HS-SPME-GC-MS分析結果Table 7 Analysis of volatile flavor components in GL by HS-SPME-GC-MS

對龍須菜良好風味貢獻較大?？傊?，經發(fā)酵生物轉化，具有脂肪味、腥臭味、魚腥味的環(huán)辛醇、1-甲基環(huán)庚醇、辛醛、正壬醛、（E）-2-壬烯醛消失、具有泥土腥味中的3-辛酮含量明顯降低，新增了具有芳香味的β-苯乙醇、水果香的己酸乙酯、酒香的辛酸乙酯、甜蜜香的乙酸苯乙酯、椰子香氣的壬酸乙酯等，這些揮發(fā)性風味物質的減增對龍須菜的脫腥增香有重要貢獻，這與楊少玲等[22]研究認為醛、酮等羰基類化合物是龍須菜腥味形成的主要物質的結果相一致。

續(xù)上表

續(xù)上表

圖5 龍須菜揮發(fā)性物質種類對比Fig. 5 Comparison of volatile substances in GL

3 討論與結論

龍須菜采用生物脫腥具有顯著效果，其中以副干酪乳桿菌副干酪亞種RP38和釀酒酵母JJ4的組合菌脫腥效果最佳。試驗中采用組合菌對龍須菜進行脫腥的效果明顯優(yōu)于單一菌種，可能是由于組合菌發(fā)酵所利用的底物面寬和代謝產物更豐富，進而風味更好。如王麗紅等[20]研究了用乳酸菌、酵母菌單菌及組合菌分別發(fā)酵海帶后風味物質的變化，結果表明組合菌發(fā)酵產生的風味物質兼于各單菌種發(fā)酵產生的，并且復合菌發(fā)酵后風味協調。

影響龍須菜生物脫腥的因素有菌接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度，其影響大小順序為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞菌接種量，經Box-Behnken響應面優(yōu)化得到龍須菜最佳的脫腥參數為：白砂糖添加量2%、蘋果酸添加量0.2%、接種量5%、發(fā)酵時間68 h及發(fā)酵溫度29 ℃，該工藝條件發(fā)酵下感官評分為73.4。

龍須菜經副干酪乳桿菌副干酪亞種RP38和釀酒酵母JJ4的組合菌生物發(fā)酵脫腥后，具有脂肪味、腥臭味、魚腥味的環(huán)辛醇、1-甲基環(huán)庚醇、辛醛、正壬醛、（E）-2-壬烯醛消失，具有泥土腥味中的3-辛酮含量明顯降低，新增了具有芳香味的β-苯乙醇、水果香的己酸乙酯、酒香的辛酸乙酯、甜蜜香的乙酸苯乙酯、椰子香氣的壬酸乙酯等，這些揮發(fā)性風味物質的減增對龍須菜的脫腥增香有重要貢獻。