張 慧，蘇光秋，林陳強(qiáng)，陳龍軍，陳濟(jì)琛

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所, 福建 福州 350001；2. 屏南縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 福建 屏南 352300）

0 引言

【研究意義】土壤微生物主要包括細(xì)菌、放線菌、真菌等[1]，既是土壤有機(jī)質(zhì)分解與轉(zhuǎn)化的參與者，也是生態(tài)系統(tǒng)碳、氮、硫、磷等元素循環(huán)的推動者[2]。土壤細(xì)菌占土壤微生物總量的70%～90%，對環(huán)境變化敏感，可作為評價土壤健康和質(zhì)量的重要指標(biāo)，在土壤養(yǎng)分循環(huán)和肥力變化中起著重要作用[3－5]。【前人研究進(jìn)展】近年來，第二代高通量測序技術(shù)在土壤微生物等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6]，可以對不同環(huán)境下微生物群落的物種組成和相對豐度等進(jìn)行細(xì)致、準(zhǔn)確的分析，極大地促進(jìn)了基因組學(xué)研究的進(jìn)展，為土壤微生物學(xué)的深入研究做出了巨大貢獻(xiàn)[7]。相較于傳統(tǒng)的測序法，高通量測序技術(shù)主要運(yùn)用芯片技術(shù)一次可以測定幾十萬甚至幾百萬的序列，通過統(tǒng)計測序 DNA的次數(shù)實現(xiàn)對 DNA 豐度的準(zhǔn)確計算，可以顯著降低測序成本?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于土壤中會發(fā)生許多重要的化學(xué)和生化反應(yīng)，從而導(dǎo)致土壤酸堿度的變化。土壤酸堿度直接影響?zhàn)B分元素存在形式及其生物有效性，土壤為微生物提供其生存及生長所需養(yǎng)分等[8]，由此可見土壤環(huán)境一旦變化會直接影響微生物的優(yōu)勢菌群和群落結(jié)構(gòu)。不同作物吸收營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素對土壤pH值的需求不同，土壤 pH值也會影響種植作物對養(yǎng)分的吸收利用和生長[9]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】黃泥田是中國南方稻區(qū)典型的低產(chǎn)田[10]，主要分布在山地丘陵，pH值平均值4.5，屬于酸性土壤。土壤酸化會提高鋁、錳的釋放數(shù)量，導(dǎo)致土壤貧瘠[11]，影響玉米種植產(chǎn)量。合理進(jìn)行土壤改良，提高黃泥田作物產(chǎn)量，以及土壤改良后土壤微生物群落如何作出響應(yīng)這方面較少研究。本研究在 Illumina Miseq平臺使用高通量測序技術(shù)分析不同施肥管理模式下，玉米根際土壤樣品中細(xì)菌16S rDNA，探討單一施化肥、化肥與土壤調(diào)理劑以及化肥配施秸稈還田施肥措施對土壤細(xì)菌多樣性、類群組成及結(jié)構(gòu)的影響，以期揭示酸性黃泥田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，為改良南方酸性土壤提高生物肥力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

研究地點(diǎn)位于福建省建甌市映山龍種業(yè)有限公司種植基地，東經(jīng)118°48′30″，北緯 27°09′26″，海拔116 m，屬中亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，全市年均氣溫 18.8 ℃，年降雨量約1 700 mm。試驗區(qū)土壤類型為黃泥田，質(zhì)地為黏土，耕層土壤pH值4.5，有機(jī)質(zhì)22.40 g·kg－1，全 氮 124.00 g·kg－1，堿 解 氮105.40 mg·kg－1，速 效 磷146.60 mg·kg－1，速 效 鉀135.00 mg·kg－1，玉米品種為‘泰鮮甜1號’。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置4個處理：不施化肥（CK）、單一施化肥（T1）、化肥配施秸稈還田（T2） 和化肥配施土壤調(diào)理劑 （T3），每個處理3次田間重復(fù)。2019年3月20日進(jìn)行試驗，小區(qū)面積為602 m2。玉米播種行距0.60 m，密度3.6萬株·hm－2。T2處理玉米秸稈還田方式為整桿埋入，還田量約為4 800 kg·hm－2。T3處理土壤調(diào)理劑原料為白云石粉與牡蠣殼粉各50%混勻，pH 10.5，施用量約為6 kg·hm－2。各處理玉米全生育期施純N 264 kg·hm－2，播種時一次性施入基肥，旋耕，基施復(fù)合肥600 kg·hm－2，氮肥為尿素，復(fù)合肥m(N)∶m(P205)∶m(K2O)為 15∶15∶15。4月21日追施純N 50 kg·hm－2，小喇叭口期配合降雨施純N 70 kg·hm－2，大喇叭口期配合降雨施純N 54 kg·hm－2。

于玉米收獲期（6月25日）在近玉米株根部10 cm 處打土鉆，采集玉米根際土壤（直徑3 cm，深度15 cm），每個處理小區(qū)多點(diǎn)取樣，充分混勻后取樣3 次重復(fù)，土壤樣品各分為2份，約50 g放入實驗室－80 ℃保存，供高通量測序分析，進(jìn)行土壤基本理化性質(zhì)分析約500 g，參照鮑士旦[12]的方法。

1.3 土壤DNA提取和高通量測序

使用Omega Soil microbial DNA extraction kit提取土壤樣品總 DNA，用 NanoDrop2000 測定DNA 的濃度和純度。以總DNA為模板用引物338F 和806R 對V3～V4 可變區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。20 μL的擴(kuò)增體系：10 ng DNA為模板，0.4 μL FastPfu 聚合酶，0.8 μL 引物，2 μL 2.5 mmol·L－1dNTPs，4 μL 5×FastPfu 緩 沖 液。擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s和延伸72 ℃ 30 s，共27個循環(huán)；最后是延伸72 ℃ 10 min。3次重復(fù)混合純化PCR 產(chǎn)物，純化產(chǎn)物利用Miseq PE300 平臺進(jìn)行測序，由上海美吉生物公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

去除OTU 單序列和嵌合體，在相似度97%水平上利用UPARSE 軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/）進(jìn)行聚類，有效序列信息物種分類注釋使用RDP classifier 軟件進(jìn)行，70%閾值比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123）。

在97%分類水平上對4組土壤處理進(jìn)行α多樣性相關(guān)分析，包括chao1、shannon、coverage、ace、simpson多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果

樣本測序列數(shù)據(jù)結(jié)果在NCBI上的登錄號為PRJNA678629。由表1可見，對12個土壤樣品細(xì)菌16s rDNA V3～V4區(qū)測序過濾后，獲得有效序列數(shù)在46 145～56 660，OTUs數(shù)在1 476～2 057，在97%相似水平下聚類統(tǒng)計得到各個土壤樣品OTU中的豐度信息。T3處理OTUs數(shù)最多，較CK處理增加14.98%，T2處理較CK處理減少0.55%，較T1處理增 加了20.53%。

表1 4種施肥措施下根際土壤細(xì)菌的序列讀數(shù)及OTUs數(shù)Table 1 Sequences and OTUs of rhizosphere bacterial community under treatments

2.2 不同施肥處理對玉米根際土壤細(xì)菌群落組成和豐度影響

Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)代表細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，豐富度隨數(shù)值升高而增高[13]；Shannon指數(shù)反映各土壤樣品多樣性，多樣性程度隨數(shù)值升高而增高；Simpson指數(shù)反映細(xì)菌類群的優(yōu)勢度[14]。表2所示，物種覆蓋率為0.987 5～0.990 9，T1處理的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)較CK均有所降低，分別為17.65%和17.88%，T3處理的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)較T1處理均有顯著提高，分別為39.06%和38.83%，說明施用土壤調(diào)理劑可以改善土壤細(xì)菌群落的豐富程度。

表2 4種施肥措施下根際土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)Table 2 Bacterial diversity of rhizosphere soil under treatments

2.3 不同處理土壤細(xì)菌類群分析

對所有土壤樣品OTUs對應(yīng)的生物分類學(xué)信息進(jìn)行統(tǒng)計，由圖1可以看出，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、Patescibacteria相對豐度較大，相對豐度之和在4組處理中均占到總量93%以上。

圖1 4種施肥措施土壤細(xì)菌門水平下類群比較Fig. 1 Bacteria at phyla level in rhizosphere soil under treatments

CK、T1和T3處理中的優(yōu)勢細(xì)菌門均為酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、變形菌門，與CK相比，單一施化肥處理放線菌門和綠彎菌門相對豐度分別增加4.08%和3.24%，變形菌門相對豐度降低3.08%；與T1相比，配施調(diào)理劑（T3）變形菌門和酸桿菌門相對豐度分別增加7.14%和1.29%，放線菌門和綠彎菌門相對豐度分別降低1.77%和9.41%。T2處理優(yōu)勢細(xì)菌門為放線菌門、綠彎菌門、變形菌門，與T1相比，配施秸稈還田（T2）變形菌門的相對豐度增加了9.46%，放線菌門和綠彎菌門的相對豐度分別降低了1.44%和7.64%。

由圖2可知，在細(xì)菌綱分類水平上，α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gamm aproteobacteria）、芽單胞菌綱 （Gemmatimonadetes）、酸桿菌綱（Acidobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、厭氧繩菌綱（Anaerolineae）、綠彎菌綱（Chloroflexia）、纖線桿菌綱（Ktedonbacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、產(chǎn)氧光細(xì)菌綱（Oxyphotobacteria）等相對豐度較大，其相對豐度之和均占到各處理土壤細(xì)菌總量的80%以上。

圖2 4種施肥措施土壤樣品細(xì)菌綱水平下類群比較Fig. 2 Bacteria at class level in rhizosphere soil under treatments

CK和T1處理細(xì)菌優(yōu)勢綱分別為酸桿菌綱、α-變形菌綱、放線菌綱、纖線桿菌綱、γ-變形菌綱，T2處理細(xì)菌優(yōu)勢綱為放線菌綱、酸桿菌綱、γ-變形菌綱、α-變形菌綱，化肥配施土壤調(diào)理劑放線菌綱、γ-變形菌綱、α-變形菌綱為優(yōu)勢綱。單一施肥的土壤細(xì)菌中γ-變形菌綱、酸桿菌綱、纖線桿菌綱的相對豐度較CK分別增加了39.43%、2.55%、15.48%，α-變形菌綱和放線菌綱相對豐度分別降低了29.27%和2.86%。與單一施肥處理相比，化肥配施秸稈還田處理增加了α-變形菌綱和酸桿菌綱的相對豐度，增加60.35%和5.85%，降低了γ-變形菌綱和放線菌綱的相對豐度，降低22.07%和6.5%；化肥配施土壤調(diào)理劑處理增加了α-變形菌綱的相對豐度，增加13.28%，γ-變形菌綱、放線菌綱、酸桿菌綱相對豐度分別降低了29.05%、37.06%、49.16%。

對相對豐度排名前50的細(xì)菌屬進(jìn)行雙向二維聚類，展示多樣品間OTUs情況（圖3），可以直觀通過顏色的梯度及相似程度清楚地獲知樣本間細(xì)菌豐度變化，顏色逐漸加深代表細(xì)菌屬相對豐度逐漸升高。圖3中12個土壤樣品分成兩大類，CK、T1和T2處理土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較相似聚為一類，T3單獨(dú)為一類。由此可知在細(xì)菌屬水平上，施入土壤調(diào)理劑對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響大于秸稈還田與常規(guī)施肥處理。鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬在T3處理相對豐度最大，叢生放線菌屬相對豐度最小。

圖3 4種施肥措施土壤樣品屬水平細(xì)菌OTUs熱圖Fig. 3 OTUs heatmap of bacterial OTUs at genus level in rhizosphere soil under treatments

通過對門水平下土壤細(xì)菌種群分布和環(huán)境因子的冗余分析，從圖4-A可以看出速效鉀、總鉀和pH的射線較長，說明對土壤樣品中細(xì)菌的影響較大，呈顯著相關(guān)性。圖4-B基于屬水平下土壤細(xì)菌種群分布和環(huán)境因子的冗余分析，pH、總磷、總鉀和速效鉀的射線較長，與土壤細(xì)菌呈顯著相關(guān)性。

圖4 基于門和屬水平下土壤細(xì)菌種群分布和環(huán)境因子的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis on bacterial community at phylum and genus levels in rhizosphere soil and on associated environmental factors

3 討論

本研究旨在探討秸稈還田和土壤調(diào)理劑的施用對酸性土壤中細(xì)菌種群多樣性的影響，目前關(guān)于這方面的報道還較少。大部分植物適應(yīng)中性或微酸性土壤生長，土壤 pH值太低會引發(fā)植物病蟲害，也會增強(qiáng)土壤中有毒金屬元素的活性。本試驗所用的土壤調(diào)理劑原料主要是白云石粉和牡蠣殼粉，有研究表明白云石粉和牡蠣殼粉在對改良酸性土壤方面有明顯效果[15]，并且對玉米生物學(xué)性狀影響方面，也表現(xiàn)出明顯的增加效果，可以明顯提高玉米地上部生物量、株高、根重與根長，且隨土壤調(diào)理劑施用量的增加而增加[16]。本研究中，化肥配施土壤調(diào)理劑處理的細(xì)菌群落豐富度較單一施化肥處理顯著提高，這可能是因為土壤調(diào)理劑的施入改善了土壤酸性環(huán)境，影響了一部分對土壤酸度極其敏感的微生物。合理的秸稈還田也可以在一定范圍內(nèi)改善土壤pH，促使其向中性土壤或是適合所種植作物生長的酸堿度變化，秸稈在土壤微生物的降解下可以釋放出大量的有機(jī)質(zhì)，增加細(xì)菌多樣性[17]。

有研究表明，施用白云石粉可以顯著降低土壤中交換性鋁含量，并且土壤中有效磷和速效鉀含量會隨著白云石粉用量的增加而增加[15]；秸稈中含有豐富的鉀資源[18－19]，秸稈還田對于土壤速效鉀含量的提高具有顯著作用[20]，一定范圍內(nèi)土壤速效鉀含量的提高會隨秸稈還田量的增加而增大[21]。本研究中速效鉀、總鉀和土壤pH對門水平下土壤細(xì)菌種群分布影響較大，呈顯著相關(guān)性；pH、總磷、總鉀和速效鉀對屬水平下土壤細(xì)菌種群分布影響較大，呈顯著相關(guān)性，可能是由于化肥配施土壤調(diào)理劑和秸稈還田提高了土壤養(yǎng)分的有效性，改變了土壤細(xì)菌群落生存環(huán)境，從而影響土壤細(xì)菌類群的相對豐富度。

CK、T1和T3處理中的優(yōu)勢細(xì)菌門為酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、變形菌門，T2處理優(yōu)勢細(xì)菌門為放線菌門、綠彎菌門、變形菌門，與前人研究結(jié)果一致[22－23]；優(yōu)勢細(xì)菌綱有α-變形菌綱、γ-變形菌綱、酸桿菌綱、放線菌綱、纖線桿菌綱。4個處理中的變形菌門相對豐度均為最大，化肥配施秸稈還田和土壤調(diào)理劑均提高了變形菌門的相對豐度，變形菌門是細(xì)菌域中最大的一門，被廣泛用于氮肥的促進(jìn)利用[24]。有相關(guān)研究表明，土壤酸桿菌的相對豐度與土壤 pH 值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[25]，也有研究表明因受土壤其他環(huán)境因子影響，酸桿菌的相對豐度與土壤 pH 相關(guān)性不顯著[26]。本研究中，化肥配施土壤調(diào)理劑處理的酸桿菌門相對豐度較單一施化肥處理略有減少，可能是由于施用土壤調(diào)理劑增加了土壤中交換性鋁含量，酸桿菌細(xì)菌中不同亞群對土壤環(huán)境因子的適應(yīng)性存在差異有關(guān)。放線菌門可以降解土壤中的各種不溶性有機(jī)物質(zhì)，對有機(jī)物的礦化有著重要作用，從而參與自然界氮素循環(huán)[27]。單一施化肥處理放線菌門相對豐度大幅提高，可能與全氮的含量與利用有關(guān)，化肥配施秸稈還田處理較單一施化肥處理放線菌門的相對豐度略有減少，可能與秸稈還田時間有關(guān)，長期施用對放線菌門豐富度的影響會更明顯。鞘氨醇單胞菌屬對芳香化合物有極為廣泛的代謝能力，芽單孢菌屬與磷代謝相關(guān)，在化肥配施土壤調(diào)理劑處理中相對豐度最大。

4 結(jié)論

化肥配施土壤調(diào)理劑可以顯著提高土壤細(xì)菌群落豐富性。化肥配施土壤調(diào)理劑對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響大于單一施化肥和化肥配施秸稈還田處理，單一施化肥降低了土壤細(xì)菌豐富度。施用土壤調(diào)理劑提高酸性土壤 pH對玉米根際細(xì)菌群落影響最大。黃泥田酸性土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對秸稈還田和土壤調(diào)理劑的響應(yīng)機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。