張 慧，蘇光秋，林陳強(qiáng)，陳龍軍，陳濟(jì)琛

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所, 福建 福州 350001；2. 屏南縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 福建 屏南 352300）

0 引言

【研究意義】土壤微生物主要包括細(xì)菌、放線菌、真菌等[1]，既是土壤有機(jī)質(zhì)分解與轉(zhuǎn)化的參與者，也是生態(tài)系統(tǒng)碳、氮、硫、磷等元素循環(huán)的推動(dòng)者[2]。土壤細(xì)菌占土壤微生物總量的70%～90%，對(duì)環(huán)境變化敏感，可作為評(píng)價(jià)土壤健康和質(zhì)量的重要指標(biāo)，在土壤養(yǎng)分循環(huán)和肥力變化中起著重要作用[3－5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，第二代高通量測序技術(shù)在土壤微生物等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6]，可以對(duì)不同環(huán)境下微生物群落的物種組成和相對(duì)豐度等進(jìn)行細(xì)致、準(zhǔn)確的分析，極大地促進(jìn)了基因組學(xué)研究的進(jìn)展，為土壤微生物學(xué)的深入研究做出了巨大貢獻(xiàn)[7]。相較于傳統(tǒng)的測序法，高通量測序技術(shù)主要運(yùn)用芯片技術(shù)一次可以測定幾十萬甚至幾百萬的序列，通過統(tǒng)計(jì)測序 DNA的次數(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì) DNA 豐度的準(zhǔn)確計(jì)算，可以顯著降低測序成本?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于土壤中會(huì)發(fā)生許多重要的化學(xué)和生化反應(yīng)，從而導(dǎo)致土壤酸堿度的變化。土壤酸堿度直接影響?zhàn)B分元素存在形式及其生物有效性，土壤為微生物提供其生存及生長所需養(yǎng)分等[8]，由此可見土壤環(huán)境一旦變化會(huì)直接影響微生物的優(yōu)勢(shì)菌群和群落結(jié)構(gòu)。不同作物吸收營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素對(duì)土壤pH值的需求不同，土壤 pH值也會(huì)影響種植作物對(duì)養(yǎng)分的吸收利用和生長[9]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】黃泥田是中國南方稻區(qū)典型的低產(chǎn)田[10]，主要分布在山地丘陵，pH值平均值4.5，屬于酸性土壤。土壤酸化會(huì)提高鋁、錳的釋放數(shù)量，導(dǎo)致土壤貧瘠[11]，影響玉米種植產(chǎn)量。合理進(jìn)行土壤改良，提高黃泥田作物產(chǎn)量，以及土壤改良后土壤微生物群落如何作出響應(yīng)這方面較少研究。本研究在 Illumina Miseq平臺(tái)使用高通量測序技術(shù)分析不同施肥管理模式下，玉米根際土壤樣品中細(xì)菌16S rDNA，探討單一施化肥、化肥與土壤調(diào)理劑以及化肥配施秸稈還田施肥措施對(duì)土壤細(xì)菌多樣性、類群組成及結(jié)構(gòu)的影響，以期揭示酸性黃泥田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，為改良南方酸性土壤提高生物肥力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

研究地點(diǎn)位于福建省建甌市映山龍種業(yè)有限公司種植基地，東經(jīng)118°48′30″，北緯 27°09′26″，海拔116 m，屬中亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，全市年均氣溫 18.8 ℃，年降雨量約1 700 mm。試驗(yàn)區(qū)土壤類型為黃泥田，質(zhì)地為黏土，耕層土壤pH值4.5，有機(jī)質(zhì)22.40 g·kg－1，全 氮 124.00 g·kg－1，堿 解 氮105.40 mg·kg－1，速 效 磷146.60 mg·kg－1，速 效 鉀135.00 mg·kg－1，玉米品種為‘泰鮮甜1號(hào)’。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理：不施化肥（CK）、單一施化肥（T1）、化肥配施秸稈還田（T2） 和化肥配施土壤調(diào)理劑 （T3），每個(gè)處理3次田間重復(fù)。2019年3月20日進(jìn)行試驗(yàn)，小區(qū)面積為602 m2。玉米播種行距0.60 m，密度3.6萬株·hm－2。T2處理玉米秸稈還田方式為整桿埋入，還田量約為4 800 kg·hm－2。T3處理土壤調(diào)理劑原料為白云石粉與牡蠣殼粉各50%混勻，pH 10.5，施用量約為6 kg·hm－2。各處理玉米全生育期施純N 264 kg·hm－2，播種時(shí)一次性施入基肥，旋耕，基施復(fù)合肥600 kg·hm－2，氮肥為尿素，復(fù)合肥m(N)∶m(P205)∶m(K2O)為 15∶15∶15。4月21日追施純N 50 kg·hm－2，小喇叭口期配合降雨施純N 70 kg·hm－2，大喇叭口期配合降雨施純N 54 kg·hm－2。

于玉米收獲期（6月25日）在近玉米株根部10 cm 處打土鉆，采集玉米根際土壤（直徑3 cm，深度15 cm），每個(gè)處理小區(qū)多點(diǎn)取樣，充分混勻后取樣3 次重復(fù)，土壤樣品各分為2份，約50 g放入實(shí)驗(yàn)室－80 ℃保存，供高通量測序分析，進(jìn)行土壤基本理化性質(zhì)分析約500 g，參照鮑士旦[12]的方法。

1.3 土壤DNA提取和高通量測序

使用Omega Soil microbial DNA extraction kit提取土壤樣品總 DNA，用 NanoDrop2000 測定DNA 的濃度和純度。以總DNA為模板用引物338F 和806R 對(duì)V3～V4 可變區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。20 μL的擴(kuò)增體系：10 ng DNA為模板，0.4 μL FastPfu 聚合酶，0.8 μL 引物，2 μL 2.5 mmol·L－1dNTPs，4 μL 5×FastPfu 緩 沖 液。擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s和延伸72 ℃ 30 s，共27個(gè)循環(huán)；最后是延伸72 ℃ 10 min。3次重復(fù)混合純化PCR 產(chǎn)物，純化產(chǎn)物利用Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測序，由上海美吉生物公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

去除OTU 單序列和嵌合體，在相似度97%水平上利用UPARSE 軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/）進(jìn)行聚類，有效序列信息物種分類注釋使用RDP classifier 軟件進(jìn)行，70%閾值比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123）。

在97%分類水平上對(duì)4組土壤處理進(jìn)行α多樣性相關(guān)分析，包括chao1、shannon、coverage、ace、simpson多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果

樣本測序列數(shù)據(jù)結(jié)果在NCBI上的登錄號(hào)為PRJNA678629。由表1可見，對(duì)12個(gè)土壤樣品細(xì)菌16s rDNA V3～V4區(qū)測序過濾后，獲得有效序列數(shù)在46 145～56 660，OTUs數(shù)在1 476～2 057，在97%相似水平下聚類統(tǒng)計(jì)得到各個(gè)土壤樣品OTU中的豐度信息。T3處理OTUs數(shù)最多，較CK處理增加14.98%，T2處理較CK處理減少0.55%，較T1處理增 加了20.53%。

表1 4種施肥措施下根際土壤細(xì)菌的序列讀數(shù)及OTUs數(shù)Table 1 Sequences and OTUs of rhizosphere bacterial community under treatments

2.2 不同施肥處理對(duì)玉米根際土壤細(xì)菌群落組成和豐度影響

Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)代表細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，豐富度隨數(shù)值升高而增高[13]；Shannon指數(shù)反映各土壤樣品多樣性，多樣性程度隨數(shù)值升高而增高；Simpson指數(shù)反映細(xì)菌類群的優(yōu)勢(shì)度[14]。表2所示，物種覆蓋率為0.987 5～0.990 9，T1處理的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)較CK均有所降低，分別為17.65%和17.88%，T3處理的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)較T1處理均有顯著提高，分別為39.06%和38.83%，說明施用土壤調(diào)理劑可以改善土壤細(xì)菌群落的豐富程度。

表2 4種施肥措施下根際土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)Table 2 Bacterial diversity of rhizosphere soil under treatments

2.3 不同處理土壤細(xì)菌類群分析

對(duì)所有土壤樣品OTUs對(duì)應(yīng)的生物分類學(xué)信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，由圖1可以看出，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、Patescibacteria相對(duì)豐度較大，相對(duì)豐度之和在4組處理中均占到總量93%以上。

圖1 4種施肥措施土壤細(xì)菌門水平下類群比較Fig. 1 Bacteria at phyla level in rhizosphere soil under treatments

CK、T1和T3處理中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門均為酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、變形菌門，與CK相比，單一施化肥處理放線菌門和綠彎菌門相對(duì)豐度分別增加4.08%和3.24%，變形菌門相對(duì)豐度降低3.08%；與T1相比，配施調(diào)理劑（T3）變形菌門和酸桿菌門相對(duì)豐度分別增加7.14%和1.29%，放線菌門和綠彎菌門相對(duì)豐度分別降低1.77%和9.41%。T2處理優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為放線菌門、綠彎菌門、變形菌門，與T1相比，配施秸稈還田（T2）變形菌門的相對(duì)豐度增加了9.46%，放線菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度分別降低了1.44%和7.64%。

由圖2可知，在細(xì)菌綱分類水平上，α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gamm aproteobacteria）、芽單胞菌綱 （Gemmatimonadetes）、酸桿菌綱（Acidobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、厭氧繩菌綱（Anaerolineae）、綠彎菌綱（Chloroflexia）、纖線桿菌綱（Ktedonbacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、產(chǎn)氧光細(xì)菌綱（Oxyphotobacteria）等相對(duì)豐度較大，其相對(duì)豐度之和均占到各處理土壤細(xì)菌總量的80%以上。

圖2 4種施肥措施土壤樣品細(xì)菌綱水平下類群比較Fig. 2 Bacteria at class level in rhizosphere soil under treatments

CK和T1處理細(xì)菌優(yōu)勢(shì)綱分別為酸桿菌綱、α-變形菌綱、放線菌綱、纖線桿菌綱、γ-變形菌綱，T2處理細(xì)菌優(yōu)勢(shì)綱為放線菌綱、酸桿菌綱、γ-變形菌綱、α-變形菌綱，化肥配施土壤調(diào)理劑放線菌綱、γ-變形菌綱、α-變形菌綱為優(yōu)勢(shì)綱。單一施肥的土壤細(xì)菌中γ-變形菌綱、酸桿菌綱、纖線桿菌綱的相對(duì)豐度較CK分別增加了39.43%、2.55%、15.48%，α-變形菌綱和放線菌綱相對(duì)豐度分別降低了29.27%和2.86%。與單一施肥處理相比，化肥配施秸稈還田處理增加了α-變形菌綱和酸桿菌綱的相對(duì)豐度，增加60.35%和5.85%，降低了γ-變形菌綱和放線菌綱的相對(duì)豐度，降低22.07%和6.5%；化肥配施土壤調(diào)理劑處理增加了α-變形菌綱的相對(duì)豐度，增加13.28%，γ-變形菌綱、放線菌綱、酸桿菌綱相對(duì)豐度分別降低了29.05%、37.06%、49.16%。

對(duì)相對(duì)豐度排名前50的細(xì)菌屬進(jìn)行雙向二維聚類，展示多樣品間OTUs情況（圖3），可以直觀通過顏色的梯度及相似程度清楚地獲知樣本間細(xì)菌豐度變化，顏色逐漸加深代表細(xì)菌屬相對(duì)豐度逐漸升高。圖3中12個(gè)土壤樣品分成兩大類，CK、T1和T2處理土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較相似聚為一類，T3單獨(dú)為一類。由此可知在細(xì)菌屬水平上，施入土壤調(diào)理劑對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響大于秸稈還田與常規(guī)施肥處理。鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬在T3處理相對(duì)豐度最大，叢生放線菌屬相對(duì)豐度最小。

圖3 4種施肥措施土壤樣品屬水平細(xì)菌OTUs熱圖Fig. 3 OTUs heatmap of bacterial OTUs at genus level in rhizosphere soil under treatments

通過對(duì)門水平下土壤細(xì)菌種群分布和環(huán)境因子的冗余分析，從圖4-A可以看出速效鉀、總鉀和pH的射線較長，說明對(duì)土壤樣品中細(xì)菌的影響較大，呈顯著相關(guān)性。圖4-B基于屬水平下土壤細(xì)菌種群分布和環(huán)境因子的冗余分析，pH、總磷、總鉀和速效鉀的射線較長，與土壤細(xì)菌呈顯著相關(guān)性。

圖4 基于門和屬水平下土壤細(xì)菌種群分布和環(huán)境因子的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis on bacterial community at phylum and genus levels in rhizosphere soil and on associated environmental factors

3 討論

本研究旨在探討秸稈還田和土壤調(diào)理劑的施用對(duì)酸性土壤中細(xì)菌種群多樣性的影響，目前關(guān)于這方面的報(bào)道還較少。大部分植物適應(yīng)中性或微酸性土壤生長，土壤 pH值太低會(huì)引發(fā)植物病蟲害，也會(huì)增強(qiáng)土壤中有毒金屬元素的活性。本試驗(yàn)所用的土壤調(diào)理劑原料主要是白云石粉和牡蠣殼粉，有研究表明白云石粉和牡蠣殼粉在對(duì)改良酸性土壤方面有明顯效果[15]，并且對(duì)玉米生物學(xué)性狀影響方面，也表現(xiàn)出明顯的增加效果，可以明顯提高玉米地上部生物量、株高、根重與根長，且隨土壤調(diào)理劑施用量的增加而增加[16]。本研究中，化肥配施土壤調(diào)理劑處理的細(xì)菌群落豐富度較單一施化肥處理顯著提高，這可能是因?yàn)橥寥勒{(diào)理劑的施入改善了土壤酸性環(huán)境，影響了一部分對(duì)土壤酸度極其敏感的微生物。合理的秸稈還田也可以在一定范圍內(nèi)改善土壤pH，促使其向中性土壤或是適合所種植作物生長的酸堿度變化，秸稈在土壤微生物的降解下可以釋放出大量的有機(jī)質(zhì)，增加細(xì)菌多樣性[17]。

有研究表明，施用白云石粉可以顯著降低土壤中交換性鋁含量，并且土壤中有效磷和速效鉀含量會(huì)隨著白云石粉用量的增加而增加[15]；秸稈中含有豐富的鉀資源[18－19]，秸稈還田對(duì)于土壤速效鉀含量的提高具有顯著作用[20]，一定范圍內(nèi)土壤速效鉀含量的提高會(huì)隨秸稈還田量的增加而增大[21]。本研究中速效鉀、總鉀和土壤pH對(duì)門水平下土壤細(xì)菌種群分布影響較大，呈顯著相關(guān)性；pH、總磷、總鉀和速效鉀對(duì)屬水平下土壤細(xì)菌種群分布影響較大，呈顯著相關(guān)性，可能是由于化肥配施土壤調(diào)理劑和秸稈還田提高了土壤養(yǎng)分的有效性，改變了土壤細(xì)菌群落生存環(huán)境，從而影響土壤細(xì)菌類群的相對(duì)豐富度。

CK、T1和T3處理中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、變形菌門，T2處理優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為放線菌門、綠彎菌門、變形菌門，與前人研究結(jié)果一致[22－23]；優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱有α-變形菌綱、γ-變形菌綱、酸桿菌綱、放線菌綱、纖線桿菌綱。4個(gè)處理中的變形菌門相對(duì)豐度均為最大，化肥配施秸稈還田和土壤調(diào)理劑均提高了變形菌門的相對(duì)豐度，變形菌門是細(xì)菌域中最大的一門，被廣泛用于氮肥的促進(jìn)利用[24]。有相關(guān)研究表明，土壤酸桿菌的相對(duì)豐度與土壤 pH 值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[25]，也有研究表明因受土壤其他環(huán)境因子影響，酸桿菌的相對(duì)豐度與土壤 pH 相關(guān)性不顯著[26]。本研究中，化肥配施土壤調(diào)理劑處理的酸桿菌門相對(duì)豐度較單一施化肥處理略有減少，可能是由于施用土壤調(diào)理劑增加了土壤中交換性鋁含量，酸桿菌細(xì)菌中不同亞群對(duì)土壤環(huán)境因子的適應(yīng)性存在差異有關(guān)。放線菌門可以降解土壤中的各種不溶性有機(jī)物質(zhì)，對(duì)有機(jī)物的礦化有著重要作用，從而參與自然界氮素循環(huán)[27]。單一施化肥處理放線菌門相對(duì)豐度大幅提高，可能與全氮的含量與利用有關(guān)，化肥配施秸稈還田處理較單一施化肥處理放線菌門的相對(duì)豐度略有減少，可能與秸稈還田時(shí)間有關(guān)，長期施用對(duì)放線菌門豐富度的影響會(huì)更明顯。鞘氨醇單胞菌屬對(duì)芳香化合物有極為廣泛的代謝能力，芽單孢菌屬與磷代謝相關(guān)，在化肥配施土壤調(diào)理劑處理中相對(duì)豐度最大。

4 結(jié)論

化肥配施土壤調(diào)理劑可以顯著提高土壤細(xì)菌群落豐富性。化肥配施土壤調(diào)理劑對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響大于單一施化肥和化肥配施秸稈還田處理，單一施化肥降低了土壤細(xì)菌豐富度。施用土壤調(diào)理劑提高酸性土壤 pH對(duì)玉米根際細(xì)菌群落影響最大。黃泥田酸性土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)秸稈還田和土壤調(diào)理劑的響應(yīng)機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。