熊浙徽，張惠惠，張自清，馬騁晨，齊 宇，李紅俠

（宿州學(xué)院，安徽宿州 234000）

白楊素又名1，2-苯并吡喃酮，屬于黃酮類化合物，可從紫葳科植物木蝴蝶中提取，尤其蜂膠中含量較高［1-2］，它具有多種生物活性和藥理作用［3-7］.谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)信號傳遞的主要遞質(zhì)之一，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要的作用［8］.當(dāng)谷氨酸濃度過高時，會引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，導(dǎo)致線粒體功能受損，進(jìn)而產(chǎn)生更多的氧自由基，加重細(xì)胞的損傷、衰老和死亡.近年來研究發(fā)現(xiàn)腦缺血［9-10］、肌萎縮側(cè)索硬化癥、帕金森氏癥、阿爾茨海默病［11-13］等神經(jīng)性疾病均是由谷氨酸釋放量過高引起的.臨床研究表明，由神經(jīng)損傷引起的疾病發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、致殘率、致死率都較高，但有效治療藥物少，治愈率低［14］.

HT22細(xì)胞系是小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系，來自HT4.正常狀態(tài)下貼壁生長，普通DMEM 培養(yǎng)基加上血清，雙抗即可培養(yǎng).該細(xì)胞系是體外研究谷氨酸毒性的良好模型，在很多神經(jīng)退化性疾病，例如阿爾茨海默病和帕金森中均有很好的應(yīng)用.本實(shí)驗(yàn)以谷氨酸誘導(dǎo)HT22 細(xì)胞建立模型，通過加入白楊素衍生物，研究白楊素衍生物對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，以期為相關(guān)疾病的治療提供借鑒依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料及試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

本實(shí)驗(yàn)所用儀器主要有掃描酶標(biāo)儀（Sunrise，奧地利TECAN），流式細(xì)胞儀（C6，BD 公司），CO2培養(yǎng)箱（Heracel，美國Kendro），倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS CX -40，日本OLYMPUS），激光共聚焦顯微鏡（FV1200+IX83，日本Olympus），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和共聚焦專用小皿，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和6孔細(xì)胞等.

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料為HT22細(xì)胞株，由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供.

實(shí)驗(yàn)所用試劑有DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（北京索萊寶生物科技有限公司），雙抗、MTT（碧云天生物技術(shù)有限公司），線粒體膜電位檢測試劑盒和活性氧檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），白楊素衍生物由宿州學(xué)院化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，以下以CD表示.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞存活率測定

將處于對數(shù)生長期的HT22細(xì)胞分為對照組（完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h）、模型組也稱谷氨酸處理組（細(xì)胞正常培養(yǎng)12 h 后，與谷氨酸作用24 h）和藥物組（細(xì)胞正常培養(yǎng)12 h 后加10 mmol/L 谷氨酸1h，然加終濃度為2.5、5、10 μmol/L 的白楊素衍生物繼續(xù)培養(yǎng)24 h）.白楊素衍生物終濃度為2.5、5、10、25 μmol/L，谷氨酸濃度10 mmol/L.

將對數(shù)生長期的HT22細(xì)胞，按每孔2×105細(xì)胞培養(yǎng)于96 孔板中，每孔加入100 μL，每組3個重復(fù)，待細(xì)胞貼壁后，對照組加入100 μL的完全培養(yǎng)基，模型組加入100 μL含谷氨酸濃度10 mmol/L的完全培養(yǎng)基，藥物組加谷氨酸濃度10 mmol/L，1 h后，加藥物CD的終濃度分別為2.5、5、10 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)（培養(yǎng)箱溫度37℃，CO2濃度5%），24 h 后加MTT（濃度5 mg/mL，每孔15 μL），繼續(xù)孵育4 h 后，棄去每孔的液體，加150 μL 的二甲亞砜，于水平搖床震蕩8 -10 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm 處的吸光度值（A）和細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對照組OD值/對照組OD值-空白對照組OD值）x 100.

2.2 細(xì)胞線粒體膜電位檢測

將HT22 細(xì)胞接種于共聚焦專用細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按實(shí)驗(yàn)分組，對照組、谷氨酸組、藥物組24 h后，棄去培養(yǎng)液，采用JC-1 試劑盒檢測HT22 細(xì)胞線粒體膜電位，加入10 μg/mL JC-1 染液，于37 ℃下孵育20-25 min，用置于冰浴下的JC-1 染色緩沖液（1X）洗3 遍，加入1.5 mLDMEM 培養(yǎng)液，于激光共聚焦顯微鏡下在激發(fā)光為488和Cy3下，采集熒光信號.當(dāng)線粒體膜電位低時，JC-1產(chǎn)生綠色熒光；當(dāng)線粒體膜電位高時，JC-1 產(chǎn)生紅色熒光，通過Image J 軟件進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度的半定量分析，以紅/綠相對熒光強(qiáng)度比來反映線粒體膜電位的變化.

2.3 細(xì)胞活性氧檢測

將HT22 細(xì)胞接種于共聚焦專用細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按實(shí)驗(yàn)分組，對照組、谷氨酸組、藥物組24 h后，棄去培養(yǎng)液，采用ROS Assay Kit 試劑盒檢測HT22 細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS 水平.加入終濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育25 min 左右，用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液洗3 遍后，加入1.5 mLDMEM 培養(yǎng)液，于激光共聚焦顯微鏡在FITC 的參數(shù)設(shè)置下，采集熒光信號，通過Image J 軟件進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度的半定量分析.

2.4 AV/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

用Annexin V/PI 流式細(xì)胞儀來檢測神經(jīng)細(xì)胞HT22的凋亡，將對數(shù)生長期的HT22細(xì)胞接種6孔板（2×108個/mL細(xì)胞），根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，分組方法同活性氧，對照組加相同量的細(xì)胞培養(yǎng)基.培養(yǎng)結(jié)束后（24 h），將細(xì)胞收集，PBS（冷的）漂洗2次，懸浮于300 μL Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC/PI染色5 min后，再加入5 μL PI，輕振混勻，再加200 μL Binding Buffer，室溫避光反應(yīng)15 min，上機(jī)檢測.用Flowjo7.6.1（FACSCA2BUR，Becton Dickinson，USA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及出圖.

3 結(jié)果與分析

3.1 藥物CD的性狀

藥物CD為淺黃色固體粉末，熔點(diǎn)187℃～190℃，分子量525.38，分子式C27H22Cl2N2O5.

3.2 藥物對谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響

由圖1a 可知，藥物CD 對HT22 細(xì)胞存活率的影響，隨著藥物濃度的增加而降低，因此，適宜的藥物濃度用量在2.5～10 μmol/L.圖1b顯示，10 mmol/L的谷氨酸處理24 h，谷氨酸模型組與對照組細(xì)胞相比較存活率下降一半，其存活率為50.111±0.34%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著性差異.藥物處理組與模型組比較，藥物處理濃度為2.5、5、10 μmol/L 時，存活率為61.819±0.23%、71.688±0.56%、83.223±0.72%，細(xì)胞存活率顯著升高.當(dāng)藥物濃度為10 μmol/L 時，細(xì)胞存活率達(dá)到最高，比模型組高出1.66 倍，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著性差異.藥物處理組提高了細(xì)胞的存活率，可以降低谷氨酸對HT22細(xì)胞的損傷.

圖1 藥物（CD）對細(xì)胞存活率的影響（，n=3）

3.3 藥物對HT22細(xì)胞線粒體膜電位的影響

由圖2可知，與對照組比，谷氨酸組和藥物組（CD 分別為2.5，10μmol/L，加10 mmol/L谷氨酸）細(xì)胞紅/綠相對熒光強(qiáng)度比均顯著降低（P＜0.01），HT22 細(xì)胞線粒體膜電位均顯著下降，但藥物組處理后，細(xì)胞線粒體膜電位較模型組升高.隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞線粒體膜電位顯著增加（P＜0.01）.說明藥物對谷氨酸損傷有一定的保護(hù)作用.

圖2 藥物（CD）對HT22細(xì)胞線粒體膜電位的影響

3.4 藥物對HT22細(xì)胞活性氧的影響

由圖3 可見，與對照組比，谷氨酸組和藥物組（CD 分別為2.5，10μmol/L，加10 mmol/L 谷氨酸），HT22細(xì)胞內(nèi)相對熒光強(qiáng)度均顯著增加（P＜0.05），谷氨酸組達(dá)到極顯著增加（P＜0.01），但藥物處理組與模型組相比，細(xì)胞內(nèi)相對熒光強(qiáng)度均降低，且隨藥物濃度增加而降低，說明對細(xì)胞的損傷程度也隨之降低.

圖3 藥物（CD）對HT22細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS水平的影響

3.5 藥物對細(xì)胞凋亡的影響

使用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)，24 h后檢測各組HT22細(xì)胞的凋亡變化，圖4是流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖，圖中C表示活細(xì)胞，即FITC-/PI-；D表示早期細(xì)胞凋亡，即FITC+/PI-；B表示晚期凋亡，即FITC+/PI+；A表示死亡細(xì)胞，即FITC-/PI+.模型谷氨酸組，細(xì)胞凋亡率為34.81%，是對照組的18.82倍，藥物處理組，當(dāng)藥物濃度為2.5 μmol/L+10 mmol/L谷氨酸，細(xì)胞凋亡率為23.57%，較模型組下降11.24%，藥物濃度為10 μmol/L+10 mmol/L谷氨酸，細(xì)胞凋亡率為12.25%，較模型組下降22.56%，由此看出，藥物對谷氨酸損傷的保護(hù)作用隨藥物濃度（2.5-10 μmol/L）的增加而增強(qiáng).

圖4 谷氨酸誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物處理后的細(xì)胞凋亡

4 結(jié)論

關(guān)于谷氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞損傷導(dǎo)致的疾病，其治療藥物稀缺，去尋找和研究有效的藥物對于治療由谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有重要的意義.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10mmol/L 的谷氨酸處理的HT22 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞存活率明顯降低，線粒體膜電位顯著降低，活性氧顯著增強(qiáng)，細(xì)胞的凋亡率顯著升高；當(dāng)給與白楊素衍生物的藥物CD培養(yǎng)HT22細(xì)胞24 h，與模型組比較，細(xì)胞存活率顯著增加，在藥物CD 濃度為2.5-10 μmol/L 時，處理效果較好.線粒體膜電位較模型組顯著升高，活性氧較模型組下降，細(xì)胞凋亡較模型組降低.研究結(jié)果表明，白楊素衍生物能夠保護(hù)谷氨酸誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷.