陳 鋒 張 杰 沈 敏 羅艷輝 易躍能▲

1.湖南易能生物醫(yī)藥有限公司，湖南長沙 410005；2.湖南康爾佳制藥股份有限公司，湖南長沙 410005

當(dāng)歸補(bǔ)血湯來源于《內(nèi)外傷辨惑論》（金·李東垣），原文記載：“治肌熱，燥熱，困渴引飲，目赤面紅，晝夜不息。其脈洪大而虛，重按全無，黃芪一兩，當(dāng)歸二錢（酒洗）”，是國家藥品監(jiān)督管理局頒布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》100個目錄第51條[1]。為加快和推進(jìn)經(jīng)典名方的開發(fā)，國家藥品監(jiān)督管理局于2019年3月出臺了《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)的申報資料要求（征求意見稿）》[2]，進(jìn)一步細(xì)化和明確了古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑的研究方向及研究重點(diǎn)。國家藥品監(jiān)督管理局于2020年9月27日出臺了《中藥注冊分類及申報資料要求》[3]，規(guī)定古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑為中藥新藥，屬于中藥注冊分類中的第三類，極大地推進(jìn)了經(jīng)典名方中藥新藥的發(fā)展。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯主要功效是補(bǔ)氣生血，主治：勞倦內(nèi)傷，氣弱血虛，陽浮外越。肌熱面赤，煩渴欲飲，脈洪大而虛，以及婦人經(jīng)行、產(chǎn)后血虛發(fā)熱頭痛?；虔彲儩⒑?，久不愈合者[4]。臨床研究表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯的臨床功效對心、腎、肝、血液、骨、腫瘤等疾病有良好療效[5]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯歷代的制法為：上?咀，都作一服。水二盞，煎至一盞，去渣，溫服，空心食前。當(dāng)歸補(bǔ)血湯的化學(xué)成分現(xiàn)代化研究較多，但缺乏規(guī)范化質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。為了優(yōu)選當(dāng)歸補(bǔ)血湯的含量測定條件，本文對當(dāng)歸補(bǔ)血湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸的含量進(jìn)行了HPLC法同時測定，并進(jìn)行了方法學(xué)的考察，為當(dāng)歸補(bǔ)血相關(guān)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695色譜系統(tǒng)，包括四元梯度輸液泵（Alliance 2695型）、120位高性能自動進(jìn)樣器、原裝進(jìn)口色譜柱溫箱、 Waters 2996型 DAD二極管陣列檢測器、Empower 3色譜管理系統(tǒng)；SHIMADZU（島津）AUW120D十萬分之一電子天平（日本島津公司）；電熱恒溫水浴鍋：HH-S24型（金壇市大地自動化儀器）；電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140（上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超聲清洗機(jī)：KQ-500DB型（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

試藥：毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：111920-201606，純度為97.6%，中國食品藥品檢定研究院），阿魏酸（批號：110773-201614，純度為99.0%，中國食品藥品檢定研究院）；當(dāng)歸、黃芪藥材均購自甘肅岷歸中藥材科技有限公司，經(jīng)鑒定符合《中國藥典》2015版的要求[6]。乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；磷酸（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫鉀（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5TC-C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動相：乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）；流速：1.0 ml/min；波長：280 nm；進(jìn)樣量：30 μl；柱溫：30℃；理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計算不低于8000，毛蕊異黃酮葡萄糖苷與阿魏酸分離度不得小于4.0；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.1.1 對照品溶液的制備 取阿魏酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 ml各含阿魏酸15 μg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷30 μg的混合溶液，搖勻，濾過，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 分別取當(dāng)歸補(bǔ)血湯凍干粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液，備用。按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件分別精密吸取對照品溶液以及供試品溶液各30 μl進(jìn)樣，得色譜圖。見圖1。

圖1 A當(dāng)歸補(bǔ)血湯對照品色圖譜；B當(dāng)歸補(bǔ)血湯供試品色圖譜

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系 取阿魏酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，分別配制5個不同濃度的混合對照品溶液，進(jìn)樣，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，求得阿魏酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的回歸方程見表2，結(jié)果表明阿魏酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸線性關(guān)系

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定，結(jié)果阿魏酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積RSD%均＜3.0%，表明本儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按色譜條件，分別在 0、2、6、12、24 進(jìn)樣測定，結(jié)果阿魏酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積RSD%均＜3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批物質(zhì)基準(zhǔn)樣品5份，按上述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果阿魏酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均含量分別為0.033 mg/g和0.073 mg/g，RSD%分別為3.0%和3.6%，參照《中國藥典》2015年版四部9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則重復(fù)性RSD%可接受范圍判定[7]，表明本方法具有較好的重復(fù)性。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的物質(zhì)基準(zhǔn)樣品，精密加入對照品溶液適量，按上述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，結(jié)果阿魏酸加樣回收率在100%～106%之間，平均回收率為98.63%，RSD%為2.2%，毛蕊異黃酮葡萄糖加樣回收率在95%～106%之間，平均回收率為102.25%，RSD%為3.3%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.2.6 樣品含量測定 分別取20批不同批次物質(zhì)基準(zhǔn)樣品，按照上述方法測定，結(jié)果阿魏酸的含量范圍為0.010%～0.031%，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量范圍為0.058%～0.093%，見表3。

表3 20批當(dāng)歸補(bǔ)血湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品含量測定結(jié)果（%）

3 討論

中醫(yī)藥是中國的國粹，經(jīng)典名方應(yīng)用歷史悠久，臨床療效確切，是中醫(yī)藥寶庫中最核心的部分。對中藥經(jīng)典名方進(jìn)行系統(tǒng)研究與開發(fā)，傳承經(jīng)典，守正創(chuàng)新，中醫(yī)藥將迎來發(fā)展的春天。前期大量學(xué)者對當(dāng)歸補(bǔ)血湯已做了深入研究工作，如化學(xué)成分研究、藥理學(xué)研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、制備工藝研究等。研究結(jié)果表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯中主要活性成分為阿魏酸、多糖類、黃芪異黃酮類、黃芪皂苷類等，但不同功效對應(yīng)的具體藥效成分還未明確[8]。當(dāng)歸的主要藥理活性成分是阿魏酸，阿魏酸是于1979年林茂等[9]首次從當(dāng)歸中提取分離，大量研究人員對阿魏酸的提取分離與含量測定方法進(jìn)行了研究。阿魏酸是中國藥典（2020年版）當(dāng)歸藥材與飲片的含量檢測指標(biāo)。阿魏酸存在于多種藥材中，不屬于當(dāng)歸的特征性指標(biāo)成分。此外，當(dāng)歸中還含有煙酸、十六烷羧酸、棕櫚酸、鄰二苯酸、丁二酸、茴香酸、壬二酸、亞油酸等酸性成分[10]。當(dāng)歸的不同藥用部位中阿魏酸含量差異較大，其中當(dāng)歸身含量最低，當(dāng)歸尾含量最高[11]。藥理研究表明：阿魏酸具有補(bǔ)血活血、抗炎、清除自由基、提高機(jī)體免疫等功效[12]。

黃芪中的黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，目前從黃芪植物中已分離得到多種黃酮類化合物，其中異黃酮主要包括毛蕊異黃酮、芒柄花素葡萄糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素[13]。《中國藥典》2020年版也將毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為黃芪含量測定指標(biāo)之一[14]。藥理研究表明，黃芪主要活性成分毛蕊異黃酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用,是一種抗氧化、清除自由基的功效成分，同時具有顯著的抗癌活性，能夠阻止癌細(xì)胞的生長和擴(kuò)散[15]。

本研究在參考相關(guān)文獻(xiàn)[16-18]的基礎(chǔ)上，選擇毛蕊異黃酮葡萄糖、阿魏酸作為當(dāng)歸補(bǔ)血湯的含量控制指標(biāo)。其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷具有強(qiáng)抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、改善心肌功能、保護(hù)血管內(nèi)皮功能等作用，阿魏酸具有擴(kuò)張血管、抗血小板凝集、抗血栓、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等作用，兩種指標(biāo)成分的藥理活性與當(dāng)歸補(bǔ)血湯的功能主治密切相關(guān)，為當(dāng)歸補(bǔ)血復(fù)方制劑的主要藥效成分。文獻(xiàn)收載的含量測定法對本實(shí)驗(yàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯不同制品分離度欠佳，所以對洗脫條件進(jìn)行多次試驗(yàn)調(diào)整，得到的色譜峰分離度較好。本實(shí)驗(yàn)建立的當(dāng)歸補(bǔ)血湯含量測定的方法簡單，可行，重復(fù)性好，為當(dāng)歸補(bǔ)血相關(guān)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了參考。后續(xù)研究如能將當(dāng)歸補(bǔ)血湯含量測定實(shí)現(xiàn)一標(biāo)多測的同時與指紋圖譜用同一色譜條件測定，能有效提高質(zhì)量檢測效率。同時中藥制劑研究還應(yīng)不斷完善藥材、飲片、中間體及制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的構(gòu)建，促進(jìn)中藥制劑質(zhì)量研究和中藥制劑高質(zhì)量發(fā)展。