黃 虹，萬雪瑩，楊 紅，陳廷濤，鄒長偉*

(南昌大學(xué)a.資源環(huán)境與化工學(xué)院；b.鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點實驗室；c.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，江西 南昌 330031)

中國快速的工業(yè)化和交通運輸發(fā)展導(dǎo)致嚴(yán)重的空氣污染問題[1]。先前的研究表明，空氣污染已大大增加了人類呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、免疫系統(tǒng)異常和癌癥的發(fā)病率。據(jù)估計，每年約有80萬人死于空氣污染[2]。近年來許多學(xué)者開始關(guān)注空氣中顆粒物健康危害，然而顆粒物是一種復(fù)雜的、非均勻的、不同維數(shù)的顆?；旌衔?。研究表明，顆粒物的組成、大小、生物學(xué)特性和物理特性與區(qū)域、季節(jié)和時間的變化有關(guān)，因此，顆粒物暴露和毒性可能與地理位置、采樣季節(jié)、排放源、特定的大氣化學(xué)和天氣條件等[3]密切相關(guān)。除時間和空間的影響外，顆粒物的粒徑也是不可忽略的因素，研究表明細(xì)小的顆粒物(PM2.5)因比表面積小、可攜帶多種重金屬和有機(jī)物以及能夠到達(dá)肺部深處—肺泡，對人體的傷害更大[4]。

近年來，環(huán)境空氣中顆粒物的毒理學(xué)研究逐漸被科學(xué)家們所重視，然而探索室內(nèi)顆粒物對人體健康的潛在風(fēng)險和毒理作用尚為少見[5]。室內(nèi)環(huán)境對于人類的生存至關(guān)重要，現(xiàn)代人約90%的時間在室內(nèi)度過[6]，室內(nèi)環(huán)境空氣質(zhì)量對人類健康重要性不言而喻。當(dāng)今社會，各種類型的打印機(jī)被廣泛用于現(xiàn)代辦公和家庭生活。隨著打印機(jī)的廣泛使用，在打印機(jī)工作條件下室內(nèi)空氣污染對健康的影響與危害的研究顯得尤為重要且十分有必要[7]。研究發(fā)現(xiàn)長期使用打印機(jī)會導(dǎo)致眼睛瘙癢、皮膚紅斑、上呼吸道不適、塵肺、血栓形成和碳納米顆粒腹膜沉積[8- 9]等相關(guān)的職業(yè)病。研究表明打印室中的顆粒物增加了人們患呼吸系統(tǒng)疾病甚至心血管疾病的機(jī)會[10]，然而關(guān)于打印室內(nèi)顆粒物對人體的危害、影響與作用機(jī)制的研究鮮有報道。本研究采集南昌大學(xué)前湖校區(qū)某打印室PM2.5和環(huán)境樓樓頂環(huán)境空氣TSP、環(huán)境空氣PM2.5，通過對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人支氣管上皮細(xì)胞(HBE)體外染毒，來探索環(huán)境空氣TSP、PM2.5及打印室PM2.5等不同來源不同粒徑的顆粒物對HUVEC細(xì)胞和HBE的致毒作用機(jī)制，從而為明確顆粒物的毒性作用提供實驗依據(jù)，為長期接觸PM2.5所誘發(fā)的有關(guān)疾病的防控提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

打印室PM2.5采自南昌大學(xué)前湖校區(qū)某打印室，環(huán)境空氣總懸浮顆粒物(TSP)和環(huán)境空氣PM2.5采自南昌大學(xué)前湖校區(qū)資源環(huán)境與化工學(xué)院教學(xué)樓樓頂。細(xì)胞存活率(CCK-8，cell counting kit-8)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD，superoxide dismutase)試劑盒、丙二醛(MDA，malondialdehyde)試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。β肌動蛋白(β-actin)抗體、BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)(Bax，Bcl-2-associated X protein)抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2，B-cell lymphoma-2)抗體均為美國Proteintech公司產(chǎn)品。

1.1.2 細(xì)胞與儀器

HUVEC和HBE購于中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所。儀器有：1.05 m3.min-1大容量采樣器(嶗山電子儀器廠有限公司)，5 L·min-1小流量采樣器(美國Airmetrics公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(LONGYUE/龍躍)，超凈工作臺(德國The Baker Company)，酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)(北京六一儀器廠)，凝膠成像分析儀(美國BIO-RAD)，倒置熒光顯微鏡(日本OLYPUS)，水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，高壓蒸汽滅菌鍋(上海中安醫(yī)療器械廠)，-80 ℃冰箱(美國Thermo公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 顆粒物的采集與制備

空氣中的TSP和PM2.5采用1.05 m3.min-1的大容量采樣器采樣，打印室PM2.5采用5 L·min-1的小流量采樣器采樣，一次連續(xù)采樣時間均為24 h，采時均為11月1日～12月1日。濾膜采樣前保持24 h恒溫恒濕后稱重，采樣時，濾膜毛面向上，采樣24 h結(jié)束后，記錄參數(shù)，用錫紙將濾膜包裹放入-20 ℃冰箱中，保存?zhèn)溆谩?/p>

采樣膜經(jīng)超聲震蕩儀超聲振蕩，將顆粒物洗脫下來，取得顆粒物懸液，離心，次日放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥，將所得的顆粒物粉末放入-80 ℃保存。配制母液時，取適量的顆粒物干粉，用紫外線滅菌30 min，然后用無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，phosphate buffer saline)配置成濃度為10 mg·mL-1母液。實驗前吸取母液配制成實驗所需要的濃度。

1.2.2 實驗分組

環(huán)境空氣顆粒物樣本：該實驗設(shè)置對照組(不加樣品的細(xì)胞孔)，PRL組(環(huán)境空氣TSP)，PRM組(打印室PM2.5)，PRH組(環(huán)境空氣PM2.5)4個組別，濃度均為100 μg·mL-1[11]。

打印室PM2.5樣本：該實驗設(shè)置對照組(不加樣品的細(xì)胞孔)，TSP組(打印室PM2.5低濃度25 μg·mL-1)，PRM組(打印室PM2.5中濃度100 μg·mL-1)，PM組(打印室PM2.5高濃度400 μg·mL-1)4個組別。

1.2.3 細(xì)胞增殖實驗

取對數(shù)生長期的HUVEC和HBE，接種于96孔板中，每孔100 μL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培育24 h后待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行染毒實驗。加入樣本溶液，每組設(shè)置3個復(fù)孔，向96孔板中加入100 μL含有樣本的完全培養(yǎng)基。將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培育7 h后將96孔板中的液體吸出，洗3次(避免雜質(zhì)影響吸光度)每孔加入10 μLCCK-8溶液(盡量不要生成氣泡)。將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培育1～4 h后用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。細(xì)胞的存活率采用下式計劃：

細(xì)胞存活率%=(測試孔OD/對照孔OD)×100%

1.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)的測定

按照上述方法于六孔板培育細(xì)胞并染毒7 h后，每孔加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，收集上清，按照BCA濃度測定方法檢測各孔蛋白濃度。按照實驗說明書配制實驗所需試劑，并設(shè)置對照孔，對照空白孔、測定孔，測定空白孔。按照說明書在每孔中加入所需試劑，混勻后，37 ℃孵育20 min，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。按照下述公式計算SOD活性：

細(xì)胞內(nèi)SOD活性(U·mgprot-1)=SOD抑制率÷50%×(反應(yīng)體系/稀釋倍數(shù))÷待測樣本蛋白濃度(mgprot·mL-1)

1.2.4 丙二醛(MDA)的測定

按照上述方法收集細(xì)胞上清，按照BCA濃度測定方法檢測各孔蛋白濃度。按照實驗說明書配制實驗所需試劑，并設(shè)置空白管，標(biāo)準(zhǔn)管，測定管。每孔加入所需試劑，95 ℃水浴40 min，冷卻后4000 r.min-1離心10 min，吸取250 μL各管反應(yīng)液加入到新的96孔板中，用酶標(biāo)儀測定在530 nm處的吸光度。按照下述公式計算MDA含量：

細(xì)胞內(nèi)MDA含量(nmol.mgprot-1)=(測定OD值-對照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol·mL-1)÷待測樣本蛋白濃度(mgprot·mL-1)

1.2.5 Western blot測定凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

loading buffer稀釋蛋白樣品，沸水浴5 min。樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，置于5%脫脂乳-TBST(TBST，tris buffered saline tween 20)中封閉1 h，3次洗滌后，在4 ℃條件下于一抗孵育過夜，Bax/Bcl-2一抗配制應(yīng)參照一抗的說明書，按中間比例用1%脫脂乳配制一抗，其中Bax按1：5 000稀釋，Bcl-2按1：2500稀釋。然后用二抗稀釋1：5 000和1%脫脂乳-TBST在室溫下孵育60 min，滴加顯影液進(jìn)行曝光，觀察結(jié)果并計算灰度值。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

SPSS 20.0軟件(SPSS,Chicago,IL)統(tǒng)計分析。P值<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)境空氣TSP和環(huán)境空氣PM2.5對HUVEC和HBE的毒作用機(jī)制

2.1.1 細(xì)胞存活率

為了探討環(huán)境空氣TSP和環(huán)境空氣PM2.5對細(xì)胞的毒性，進(jìn)行CCK-8增殖實驗。實驗檢測結(jié)果如圖1所示，將100 μg·mL-1的環(huán)境空氣TSP和環(huán)境空氣PM2.5與HUVEC和HBE共孵育7 h后，與對照組相比，在環(huán)境空氣TSP和環(huán)境空氣PM2.5作用下，HUVEC和HBE的細(xì)胞存活率均下降，細(xì)胞存活率分別下降到71.26%和22.06%(HUVEC)，78.12%和20.89%(HBE)。與環(huán)境空氣TSP相比，環(huán)境空氣PM2.5對細(xì)胞的毒作用更大，使得細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05)。這提示我們粒徑越小的顆粒物對細(xì)胞的毒性更強(qiáng)。

圖1 環(huán)境空氣TSP、打印室PM2.5和環(huán)境空氣PM2.5對細(xì)胞存活率的影響

2.1.2 細(xì)胞氧化損傷

氧化損傷是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用的失衡，可產(chǎn)生大量活性氧，活性氧是氧化應(yīng)激最重要的分子，它在人體內(nèi)通過自然生物過程和外界刺激(如空氣污染)產(chǎn)生，通過對蛋白質(zhì)和DNA的損傷、炎癥和細(xì)胞毒性[2,12]導(dǎo)致多種病理狀態(tài)[13]。研究表明，當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化損傷時，機(jī)體中SOD活性降低，并且MDA含量升高，這是心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能損傷的重要原因之一。為了檢測顆粒物對細(xì)胞的氧化損傷程度，我們選取了SOD、MDA兩個常用的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，通過對細(xì)胞染毒7 h后細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的變化來評價顆粒物對細(xì)胞的影響。由圖2A可知，將100 μg·mL-1的環(huán)境空氣TSP和環(huán)境空氣PM2.5與HUVEC和HBE共孵育7 h后，與對照組相比，在環(huán)境空氣TSP和環(huán)境空氣PM2.5作用下HUVEC和HBE中SOD活性下降，SOD分別下降到59.14和22.31 U·mgprot-1(HUVEC)，63.28和32.41 U·mgprot-1(HBE)。與環(huán)境空氣TSP相比，環(huán)境空氣PM2.5使細(xì)胞中SOD活性顯著下降(P<0.05)。

細(xì)胞中MDA含量如圖2B所示，與對照組相比，環(huán)境空氣TSP和環(huán)境空氣PM2.5顯著升高HUVEC和HBE中MDA的含量，其中環(huán)境空氣PM2.5誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷程度最強(qiáng)，使HUVEC中的MDA含量升高17倍，使HBE中的MDA含量升高26倍(P<0.05)。這提示我們粒徑越小的顆粒物誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的能力更強(qiáng)。

2.1.3 細(xì)胞凋亡

凋亡是指細(xì)胞程序性死亡，正常情況下在機(jī)體進(jìn)化、生長發(fā)育過程中起著重要作用，但當(dāng)細(xì)胞凋亡出現(xiàn)異常，細(xì)胞群體平衡失調(diào)則易導(dǎo)致疾病的發(fā)生。目前公認(rèn)的兩條細(xì)胞凋亡途徑是死亡受體途徑和線粒體凋亡途徑[14]。死亡受體途徑是通過結(jié)合細(xì)胞表面死亡受體如TNF-α及其配體TNR，最終激活細(xì)胞收縮、染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成等下游凋亡事件的主要影響因子Caspase-3，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。線粒體凋亡途徑主要激活Bcl-2家族成員中促凋亡基因Bax的表達(dá)。Bax是最重要的促凋亡基因之一[16]，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活Caspase-3抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。除Bax因子外，在細(xì)胞凋亡過程中Bcl-2也發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[17]。Bcl-2是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，是最早發(fā)現(xiàn)的抗凋亡基因。研究發(fā)現(xiàn)正常情況下Bcl-2和Bax的表達(dá)水平基本穩(wěn)定，當(dāng)Bax在細(xì)胞中過表達(dá)時，細(xì)胞對死亡信號的響應(yīng)更強(qiáng)烈，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡；當(dāng)Bcl-2在細(xì)胞中高度表達(dá)時，抑制細(xì)胞凋亡的作用更加明顯，細(xì)胞存活時間延長[18]。因此，多項研究表明，這兩種相對蛋白的比例是決定細(xì)胞存活時間的關(guān)鍵[19]。本章主要研究Bcl-2家族調(diào)控的線粒體凋亡途徑。本研究實驗結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，環(huán)境空氣TSP和環(huán)境空氣PM2.5均顯著上調(diào)HUVEC和HBE凋亡通路中的Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)量，與環(huán)境空氣TSP相比，環(huán)境空氣PM2.5顯著上調(diào)HUVEC和HBE中Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)量(P<0.05)。本研究表明，顆粒物粒徑越小，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力越強(qiáng)。

HUVEC HBE

HUVEC

2.2 打印室PM2.5和環(huán)境空氣PM2.5對HUVEC和HBE的毒作用機(jī)制

由以上研究結(jié)果我們知道粒徑是影響顆粒物毒性的重要因素，研究表明，除了粒徑，排放源也是重要的影響因素之一[3]。

2.2.1 細(xì)胞存活率

為了探討同一粒徑不同來源的打印室PM2.5和環(huán)境空氣PM2.5對細(xì)胞的毒性，將100 μg·mL-1的打印室PM2.5和環(huán)境空氣PM2.5與HUVEC和HBE共孵育7 h后進(jìn)行CCK-8增殖實驗。實驗檢測結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，打印室PM2.5使HUVEC和HBE的細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞存活率分別下降到63.68%(HUVEC)、64.89%(HBE)，說明打印室PM2.5對細(xì)胞存活率有影響，打印室內(nèi)人群需做好防護(hù)措施。與對照組相比，環(huán)境空氣PM2.5使HUVEC和HBE的細(xì)胞存活率明顯下降，細(xì)胞存活率分別下降到22.06%(HUVEC)，20.89%(HBE)。本實驗中環(huán)境空氣PM2.5對細(xì)胞存活率的影響比打印室PM2.5的更大，分析其中一個重要的原因是本實驗中環(huán)境空氣采樣點位于南昌大學(xué)前湖校區(qū)環(huán)境樓樓頂，離采樣點直線距離約100 m有一條交通繁忙的高速公路(楓生高路前湖段)，采樣點與公路之間離地高度相當(dāng)，且無綠化隔離離地，反映道路交通相關(guān)的PM2.5對細(xì)胞生長有較明顯的抑制作用[20]。

2.2.2 細(xì)胞氧化損傷

由圖2A可知，將100 μg·mL-1的打印室PM2.5和環(huán)境空氣PM2.5與HUVEC和HBE共孵育7 h后，與對照組相比，打印室PM2.5和環(huán)境空氣PM2.5均顯著降低HUVEC和HBE中SOD的活性，分別是50.82和22.31 U·mgprot-1(HUVEC)，52.69和32.41 U·mgprot-1(HBE)。其中，與打印室PM2.5相比，環(huán)境空氣PM2.5使細(xì)胞中SOD活性顯著下降(P<0.05)。

細(xì)胞中MDA含量如圖2B所示，與對照組相比，打印室PM2.5和環(huán)境空氣PM2.5顯著升高HUVEC和HBE細(xì)胞中MDA的含量，其中與打印室PM2.5相比，環(huán)境空氣PM2.5使細(xì)胞氧化損傷程度最強(qiáng)，使HUVEC中的MDA含量升高2倍，使HBE中的MDA含量升高1.5倍(P<0.05)。本實驗中，打印室PM2.5和環(huán)境空氣PM2.5均誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷。因受楓生高速交通源影響，本實驗環(huán)境空氣采樣點采集的PM2.5誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷的影響大。

2.2.3 細(xì)胞凋亡

本研究實驗結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，打印室PM2.5和環(huán)境空氣PM2.5均顯著上調(diào)HUVEC和HBE凋亡通路中的Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)量，與打印室PM2.5相比，環(huán)境空氣PM2.5顯著上調(diào)HUVEC和HBE細(xì)胞中Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)量(P<0.05)。本實驗中，打印室PM2.5和環(huán)境空氣PM2.5均誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示當(dāng)室內(nèi)存在特定排放源(如打印源)時需注意防控室內(nèi)PM2.5對人體健康的影響；另外，本實驗中采集的環(huán)境空氣中PM2.5對HUVEC、HBE細(xì)胞凋亡影響很大，反映道路交通相關(guān)的PM2.5可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生炎癥以及凋亡[21]。

2.3 打印室PM2.5對HUVEC和HBE的毒作用機(jī)制

根據(jù)以上研究結(jié)果表明，打印室PM2.5比環(huán)境空氣PM2.5毒作用雖然略小，但因為在室內(nèi)停留時間長，對人體存在一定的傷害，由于其作用機(jī)制我們依然不了解，因此設(shè)計實驗探究其毒理機(jī)制。

2.3.1 細(xì)胞存活率

分別選擇濃度為0，25，100，400 μg·mL-1的打印室PM2.5染毒HUVEC和HBE7 h。CCK-8實驗結(jié)果如圖4所示，隨著打印室PM2.5濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低，分別是93.7%，62.1%和31.9%(HUVEC)，92.43%，49.71%和24.45%(HBE)(P<0.05)。

HUVEC

2.3.2 細(xì)胞氧化損傷

為了檢測打印室PM2.5對HUVEC和HBE細(xì)胞的氧化損傷程度，本實驗選擇SOD和MDA作為檢測指標(biāo)，SOD活性的檢測結(jié)果如圖5A所示，與對照組相比，隨著打印室PM2.5濃度的升高，HUVEC和HBE細(xì)胞中的SOD活性逐漸降低，分別是69.81，45.72和27.36 U·mgprot-1(HUVEC)，74.82、51.39和28.61 U·mgprot-1(HBE)。而HUVEC和HBE細(xì)胞中的MDA含量如圖5B所示，隨著打印室PM2.5濃度的升高，HUVEC和HBE細(xì)胞中的MDA含量逐漸升高，其中，400 μg·mL-1打印室PM2.5使HUVEC和HBE中的MDA含量均升高至對照組的9倍(P<0.05)。

HUVEC HBE

2.3.3 細(xì)胞凋亡

為了探究打印室PM2.5對細(xì)胞凋亡通路的影響，將HUVEC和HBE暴露于不同濃度打印室PM2.5中7 h后，收集細(xì)胞上清，通過western blot實驗對凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2在染毒細(xì)胞和未染毒細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。實驗結(jié)果如圖6所示，與對照組相比，隨著濃度升高，細(xì)胞中Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)量也逐漸增加，其中400 μg·mL-1染毒組細(xì)胞中的Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。

HUVEC

3 結(jié)論

環(huán)境空氣TSP、打印室PM2.5和環(huán)境空氣PM2.5對細(xì)胞生長均有抑制作用并能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡發(fā)生，且粒徑越小的顆粒物毒性越強(qiáng)，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)急和凋亡的能力也越強(qiáng)。

打印室PM2.5和環(huán)境空氣PM2.5均使細(xì)胞(HUVEC、HBE)存活率下降，導(dǎo)致細(xì)胞氧損傷和細(xì)胞凋亡，反映室內(nèi)特定的打印排放源和室外交通源使PM2.5對細(xì)胞毒害作用增強(qiáng)。

打印室PM2.5對人體健康的危害不容小覷，濃度越高，細(xì)胞存活率和SOD活性越低且MDA含量和凋亡通路中的Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)也越高。