龍小琴戴應(yīng)和

(1.貴州健康職業(yè)學(xué)院,貴州 銅仁 554300；2.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院,貴州 銅仁 554300)

肖培根院士提出藥用植物親緣學(xué),認(rèn)為中藥存在一定的親緣關(guān)系,在化學(xué)成分、藥理作用等方面有著密切的關(guān)系[1]。在同一種藥用植物不同部位的基礎(chǔ)上開展藥用部位和非藥用部位中化學(xué)成分含量研究,力求尋找新的藥用部位[2,3]。白及為銅仁市重點(diǎn)發(fā)展品牌藥材之一,白及為貴州大宗藥材,藥用價(jià)值極高,目前研究發(fā)現(xiàn),白及的主要成分為白及多糖,即白及膠,白及多糖具有活血、止血、消腫、生肌的作用,可以促進(jìn)局部炎癥物質(zhì)吸收及局部止血,可治療咳血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等病癥[4,5]。目前對(duì)白及的研究主要集中在白及塊莖的化學(xué)成分和藥理作用的研究,其它非藥部位的研究甚少。臨床上用的是白及干燥塊莖,其它部位去除,并沒(méi)有體現(xiàn)其藥用價(jià)值,加重了白及的用藥需求,擴(kuò)大研究白及其它部位中白及膠的含量成為必然趨勢(shì)。本課題就銅仁市思南產(chǎn)白及塊莖與白及非藥用部位(葉、莖稈、須根)中白及膠含量進(jìn)行比較研究,采集銅仁市思南產(chǎn)白及植株,并挑揀白及塊莖和非藥用部位。采用水提醇沉法來(lái)提取白及塊莖與非藥用部位中白及多糖,顯色劑用蒽酮-硫酸進(jìn)行顯色、再用紫外分光光度測(cè)白及塊莖與非藥用部位中白及多糖含量。力求尋找新的藥用部位,為緩解臨床用藥需求,為銅仁白及的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考思路,為白及新的藥用部位資源研究依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

循環(huán)水式多用真空泵(SHB-ⅢS,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；電子天平(BSM-220.4,上海卓精電子科技有限公司)；紅外鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9140B,上海副絮實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備廠)；低速離心機(jī)(TDZ5-WSD)；紫外可見分光光度計(jì)(TU-1800SPC)。

1.2 試藥

D-無(wú)水葡萄糖，中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)為50-99-7,濃度為100%；蒽酮，分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)為20190305；硫酸，優(yōu)級(jí)純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)為20170108；試驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制純化水；白及(采于貴州省銅仁市思南縣許家壩鎮(zhèn)中藥材現(xiàn)代高效農(nóng)業(yè)科技示范園區(qū),批號(hào)為20201001、20201002、20201003、20201004、20201005、20201006)。以上藥材均經(jīng)銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院梁玉勇教授鑒定為2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中蘭科植物中的藥用白及[Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.]植株[6]。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 蒽酮-硫酸溶液配制[7]

精密稱取蒽酮0.2011g,置于容器中,用80%的硫酸溶液溶解至100mL,搖勻,配好的0.2%蒽酮-硫酸溶液用棕色瓶保存。

2.1.2 對(duì)照品溶液[7]

用電子天平精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品0.0334g,裝到100mL的容量瓶中,用蒸餾水進(jìn)行溶解,并稀釋至刻度,進(jìn)行搖勻,即得。以100%計(jì),對(duì)照品的濃度為0.334mg·mL-1。

2.1.3 供試品溶液的制備[8]

取經(jīng)60℃干燥至恒重的白及塊莖和非藥用部位(葉、莖稈、須根),用研缽分別碾碎成粉末狀,分別放入編號(hào)的離心管中,再置于干燥器中保存。分別精密稱取樣品粉末1.0g,放入圓底燒瓶中,精密加蒸餾水50.0mL,進(jìn)行稱重,放入用電套,加熱回流1h(保持微沸),放冷,用蒸餾水補(bǔ)重,搖勻,濾過(guò)。用移液管精密量取5.0mL續(xù)濾液,加入30mL無(wú)水乙醇,進(jìn)行搖勻,放置3h,以3500r·min-1離心15min,離心后將上清液倒去,沉淀用適量熱蒸餾水溶解,放冷,置于50mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.1.4 多糖含量測(cè)定[8,9]

精密量取1mL供試品溶液,置于10mL試管中,加蒸餾水稀釋到2mL,精密加入0.2%蒽酮-硫酸試液4.5mL顯色；同時(shí)取蒸餾水2mL,置于10mL試管中,以加入0.2%蒽酮-硫酸試液4.5mL作為空白,置于紫外-可見分光光度計(jì)上在625nm波長(zhǎng)處檢測(cè),記錄吸光度。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算白及多糖的含量。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液分別為0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL,置于10mL刻度試管中,各加蒸餾水至2.0mL,搖勻,另取2.0mL蒸餾水作為空白對(duì)照。將刻度試管置于冰水浴中,精密加入顯色劑0.2%蒽酮-硫酸試液4.5mL,混勻,置于沸水浴中3min進(jìn)行加熱,立即取出置于流水中冷卻10min,以對(duì)照品溶液濃度為零的試液為空白。在625nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光度(y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程y=3.5189x-0.0108,R2=0.999,結(jié)果表明,D-無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度在5.13～51.38μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗(yàn)

取1.0mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液,加蒸餾水稀釋到2mL,按“2.1.3”中方法連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果顯示,所測(cè)吸光度的RSD為0.08%,表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取己配置好樣品溶液、D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液各1mL,按照“2.1.3”中方法顯色,以相應(yīng)試劑做空白,分別于0～3h內(nèi)每30min測(cè)定1次吸光度值,結(jié)果顯示,所測(cè)吸光度的RSD分別為0.82%和1.35%,表明樣品和對(duì)照品溶液在3h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的白及樣品6份,按樣品溶液制備項(xiàng)下方法制備樣品溶液,精密量取1mL樣品溶液,按照“2.1.3”中方法進(jìn)行顯色,測(cè)定吸光度值。結(jié)果顯示,多糖含量的RSD為2.48%,說(shuō)明方法重復(fù)性好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn)

取經(jīng)60℃干燥至恒重的白及塊莖和非藥用部位,用研缽分別碾碎成粉末狀,放入離心管中編號(hào)保存在干燥器中。精密稱取粉末1.0g,放入圓底燒瓶中,精密加蒸餾水50.0mL,進(jìn)行稱重,放入用電套,加熱回流1h(保持微沸),放冷,用蒸餾水補(bǔ)重,搖勻,過(guò)濾。用移液管精密量取5.0mL過(guò)濾液,加入30mL無(wú)水乙醇,進(jìn)行搖勻,放置3h,以3500r·min-1離心15min,離心后將上清液倒去,沉淀在60℃條件下真空干燥,精密稱取樣品0.0501g,沉淀用熱蒸餾水溶解,放冷,置250mL量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,即質(zhì)量濃度均為0.20mg·mL-1,搖勻,備用。精密吸取等量的7份樣品溶液,其中6份加入不等量標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照“2.1.3”中方法測(cè)定其吸光度值,代入線性回歸方程,確定白及多糖的量,根據(jù)不加標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品溶液的吸光度值,確定樣品中白及多糖的量,結(jié)果見表1。求得平均回收率為98.66%,RSD=1.40%。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 樣品含量測(cè)定

表2含量測(cè)定結(jié)果表明,塊莖的白及多糖含量35.12%、須根的白及多糖含量28.82%、莖稈的白及多糖含量20.93%、葉的白及多糖含量16.15%。多糖含量由高到低依次為須根>莖稈>葉。白及塊莖和非藥用部位多糖含量存在一定差異。

表2 多糖含量測(cè)定結(jié)果(x±s,n=6)

3 討論

在供試品提取方法的選擇時(shí),采用稀乙醇去除雜質(zhì)后再用水提的方法以及用水提取后再用醇沉淀的方法測(cè)定白及多糖含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2種方法測(cè)定結(jié)果差異不大,但是稀乙醇去除雜質(zhì)后再用水提的方法過(guò)濾時(shí)間太長(zhǎng),有部分含量損失,用水提取后再用醇沉淀的方法操作簡(jiǎn)便,故選擇水提醇沉法。目前有文獻(xiàn)研究證實(shí)苯酚-濃硫酸顯色法存在毒性較大,容易氧化,需純化處理才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn),操作復(fù)雜,并且在測(cè)定樣品測(cè)定結(jié)果時(shí)重復(fù)性較差；而蒽酮-硫酸顯色法測(cè)定結(jié)果時(shí)重復(fù)性較好,且操作比較簡(jiǎn)便,因此選擇蒽酮-硫酸顯色法進(jìn)行白及多糖含量測(cè)定[10,11]。研究結(jié)果顯示,塊莖的白及多糖含量35.12%、須根的白及多糖含量28.82%、莖稈的白及多糖含量20.93%、葉的白及多糖含量16.15%,多糖含量由高到低依次為須根>莖稈>葉。白及塊莖和非藥用部位(葉、莖稈、須根)多糖含量存在一定差異,可以進(jìn)一步優(yōu)化白及多糖的純化方法,為有效提高白及非藥用部位的利用,以及白及新的藥用部位資源進(jìn)一步研究提供參考。