冉新炎，齊素敏，韓廣泉，陳丹丹，陶寧，李圓圓，王麗榮

（山東碧藍(lán)生物科技有限公司／泰安市植物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000）

表面活性素（surfactin）是芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）菌株產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是由七元肽和1條β－羥基脂肪酸鏈組成的環(huán)狀脂肽，有多種同系物，根據(jù)碳鏈長(zhǎng)度可分為C12～C16共5種組分［1－3］。與一般化學(xué)表面活性劑相比，表面活性素除具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液和增加泡沫等作用外，還具備熱穩(wěn)定、無毒、生物降解性和更強(qiáng)的表面、界面活性等優(yōu)點(diǎn)［4］；具有多種生物活性，可抑制細(xì)菌、真菌、支原體的生長(zhǎng)［5，6］，其主要作用于病原菌細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，改變細(xì)胞膜通透性和功能性，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)［7］，且不易產(chǎn)生耐藥性［8，9］?？咕淖鳛楦咝П砻婊钚詣┖托滦涂咕镔|(zhì)，在農(nóng)業(yè)生物防治［10，11］、食品保鮮［12－14］、石油工業(yè)［15，16］等方面具有廣泛應(yīng)用。

surfactin天然合成量相對(duì)較低，工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)率不高，高昂的成本限制了其在多領(lǐng)域的應(yīng)用。surfactin的產(chǎn)量與菌株有關(guān)，因此提高菌株的產(chǎn)脂肽能力一直是研究熱點(diǎn)。獲得surfactin高產(chǎn)菌株是降低成本的最有效方法［4］，從環(huán)境中篩選高產(chǎn)野生菌株難度較大，國(guó)內(nèi)外研究大多集中在對(duì)原始菌株通過誘變、代謝工程改造、基因組改造等手段來提高其產(chǎn)量。李光等［17］利用常壓室溫等離子體方法對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行快速誘變獲得突變菌株B.subtilis SF90－5，其產(chǎn)surfactin能力是原始菌株的5倍。周澤宇等［18］利用代謝工程改造B.amyloliquefaciens后surfactin含量雖提高48%，但其最高產(chǎn)量?jī)H達(dá)50.17 mg／L。因此，若通過改造菌株提高其產(chǎn)surfactin能力需要建立在優(yōu)良野生菌株的前提下，但目前對(duì)高產(chǎn)surfactin野生菌株的篩選研究較少。研究者根據(jù)surfactin具有較強(qiáng)溶血細(xì)胞的能力這一特性建立了通過溶血圈來篩選產(chǎn)surfactin菌株的經(jīng)典血平板法［17］，但該方法單一且具有一定的局限性。

本研究通過血平板初篩、排油活性、抑菌試驗(yàn)、高效液相色譜法等相結(jié)合的方法從土壤中分離篩選得到一株高產(chǎn)surfactin且具有廣譜抑菌性、應(yīng)用前景廣闊的野生菌株，同時(shí)，研究了其發(fā)酵條件，旨在為進(jìn)一步提高菌株產(chǎn)surfactin能力，實(shí)現(xiàn)surfactin工業(yè)化生產(chǎn)提供更為優(yōu)質(zhì)的菌株資源和數(shù)據(jù)支持，進(jìn)而為降低開發(fā)成本奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤采自山東省泰安市周邊菜園。

根腐病病原菌和灰霉病病原菌均由山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種資源保藏中心提供。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂2%，水1 000 mL；LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl10 g，水1 000 mL，pH＝7.0，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉15 g；血瓊脂平板購(gòu)自上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司。

surfactin標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。

1.2 菌株的篩選

1.2.1 菌株的分離篩選 取土壤10 g于90 mL無菌水中，振蕩混勻，稀釋成合適梯度后涂布于LB固體培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，每種土壤樣品選取1～2個(gè)具有典型芽孢桿菌特征菌落劃線于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1 d，挑取單菌落鏡檢并接種于LB斜面，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 溶血性檢測(cè) 將分離、活化菌株接種于血平板上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，測(cè)量菌落直徑R1和溶血圈直徑R2，計(jì)算溶血性（I）。I＝（R2－R1）／R1。

1.2.3 發(fā)酵上清液的制備 將分離篩選得到的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、170 r／min培養(yǎng)48 h，10 000 r／min離心15 min，上清液過0.22 μm孔徑濾膜除菌，4℃保存。

1.2.4 排油活性檢測(cè)［19］取一直徑9 cm的培養(yǎng)皿，加入無菌水，再加入0.2 mL大豆油使之在水面形成油膜，然后在油膜中心加入0.01 mL發(fā)酵上清液，中心油膜會(huì)被擠向四周形成一個(gè)圓圈，測(cè)量排油圈的直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次取平均值。

1.2.5 拮抗性能 以根腐病和灰霉病病原菌為指示菌，采用平板對(duì)峙法：摳取病原真菌菌餅置于PDA平板四周，將供試菌株用接種環(huán)接種在平板中央，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d，用直尺測(cè)量抑菌帶大小，比較菌株對(duì)不同病原真菌的拮抗性能差異。

1.2.6 surfactin含量測(cè)定 參考艾嘉［20］液相色譜法并略加修改。HPLC分析系統(tǒng)為島津AT20，色譜柱為AQ－C18（250 mm×4.6 mm×5μm）；流動(dòng)相A為無水乙腈，流動(dòng)相B為0.1%三氟乙酸（V／V）。采用梯度淋洗方式分析，變化條件為：0～8 min：A 70%～85%，B 30%～15%；8～30 min：A:B＝85:15；31～40 min：A:B＝70:30。流速0.8 mL／min，柱溫30℃，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm，進(jìn)樣量20μL。

1.3 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)特征及生理生化性質(zhì)：將菌株接種于LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)、大小、邊緣、表面、凹凸度、透明度等，并進(jìn)行革蘭氏染色，具體測(cè)定方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［21］。

將分離菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r／min過夜培養(yǎng)［22］，取1～5 mL菌液利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株基因組DNA。利用通用引物27F（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和1492R（5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′）對(duì)細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50μL）：DNA模板2μL，Mix 25μL，27F 1μL，1492R 1μL，ddH2O 21 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃4 min；94℃30 s，52℃80 s，72℃90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃8 min。將純化后的產(chǎn)物交給上海博尚生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將得到的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.4 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［23－26］，在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取8種有利于抗菌脂肽形成的培養(yǎng)基（表1）進(jìn)行對(duì)比發(fā)酵，篩選產(chǎn)surfactin的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

表1 培養(yǎng)基種類及組成

篩選方法：在250 mL三角瓶中，先利用LB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)24 h，然后以2%的接種量接種到9種不同發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量50 mL），170 r／min、37℃、自然pH條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)48 h后，取樣檢測(cè)各瓶發(fā)酵液中的surfactin含量，確定最佳培養(yǎng)基。

1.5 surfactin最佳產(chǎn)生時(shí)間的確定

首先用LB培養(yǎng)基在37℃、170 r／min條件下培養(yǎng)24 h活化種子液，按照2%接種量接種到含50 mL篩選出的培養(yǎng)基（250 mL三角瓶）中，于37℃、170 r／min下培養(yǎng)，每4 h取樣檢測(cè)surfactin含量，初步確定surfactin最佳產(chǎn)生時(shí)間。

1.6 發(fā)酵條件的研究

以篩選出的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用單因素試驗(yàn)研究發(fā)酵條件，如pH、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速等對(duì)surfactin產(chǎn)量的影響，每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

2.1.1 溶血性、排油活性和拮抗性能 由表2可知，0077、BLK07、BLK09、BLK012、BLK014、K－19、BLK020、BLK021、BLK026、BLK027、BLK030、BLK035、BLK036、BLK041共14株菌的排油圈直徑均大于3.0 cm，具有較強(qiáng)的排油活性。上述14株菌均對(duì)灰霉病和根腐病病原菌均有一定的拮抗效果，共9株菌對(duì)兩種病原菌的抑菌帶寬均大于0.20 cm，其中有4株菌（BLK09、BLK014、K－19、BLK036）拮抗效果最好，抑菌帶寬均大于0.40 cm。部分菌株發(fā)酵上清液的排油活性和對(duì)根腐病、灰霉病病原菌的拮抗效果見圖1和圖2。上述14株菌中除BLK026、BLK030、BLK035菌株外基本無溶血性，說明溶血性并不一定是產(chǎn)surfactin菌株的典型特征。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，純生物表面活性劑的含量和透明圈的直徑呈線性關(guān)系［27］，綜合考慮，挑選菌株BLK07、BLK09、BLK014、K－19、BLK027、BLK030、BLK035、BLK036進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 菌株K－19發(fā)酵上清液的排油圈

圖2 部分菌株對(duì)灰霉病和根腐病病原菌的平板對(duì)峙試驗(yàn)

表2 分離菌株的溶血性、排油活性及其對(duì)常見植物病原菌的拮抗效果

2.1.2 發(fā)酵液中surfactin含量檢測(cè) 從圖3中可以看出，BLK09、BLK014和K－19菌株產(chǎn)表面活性素濃度均達(dá)200 mg／L以上，其中K－19菌株產(chǎn)surfactin含量最高，達(dá)366.58mg／L。在目前關(guān)于篩選產(chǎn)surfactin天然菌株的文獻(xiàn)中其surfactin產(chǎn)量處于較高水平，具有較強(qiáng)使用價(jià)值。對(duì)比排油圈直徑和HPLC檢測(cè)結(jié)果可知，排油圈直徑與surfactin產(chǎn)量有一定的相關(guān)性。

圖3 篩選菌株發(fā)酵液中surfactin含量

2.2 菌株的鑒定

K－19菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，顯微鏡下觀察呈桿狀，大小為0.6μm×（1.0～1.4）μm，具有圓形末端，單個(gè)或成對(duì)分組，形成內(nèi)生孢子；孢子為橢圓形，中生；孢子囊沒有腫脹。培養(yǎng)24 h后其菌落不光滑，不透明，邊緣不規(guī)則，乳白色，圓形菌落，直徑2～4 mm，略有齒狀邊緣，在中心有明顯褶皺突起，質(zhì)地粘稠（圖4）。具體生理生化特征見表3。

表3 K－19菌株的生理生化特性

圖4 菌株K－19菌落形態(tài)

BLAST比對(duì)分析結(jié)果表明，K－19菌株與Bacillus velesensis strain EN01、Bacillus velesensis strain LB002、Bacillus amyloliquefaciens strain V167、Bacillus velesensis strain YL17的同源性分別為99.93%、99.93%、99.79%、99.79%。綜合形態(tài)特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析，確定該菌株屬于貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velesensis）。

2.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

以LB培養(yǎng)基的產(chǎn)量（366.58 mg／L）為對(duì)照，在同種發(fā)酵條件下，8號(hào)培養(yǎng)基的surfactin產(chǎn)量顯著提高（843.24 mg／L）（圖5），約為L(zhǎng)B培養(yǎng)基的2.3倍；其次是6號(hào)和7號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分均含有豆粕和葡萄糖。6號(hào)培養(yǎng)基在7號(hào)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了微量元素，說明鐵、鎂、錳離子能共同促進(jìn)抗菌脂肽surfactin的產(chǎn)生。有研究顯示［28－31］，Mg2＋、K＋、Mn2＋和Fe2＋等離子對(duì)抗菌脂肽的產(chǎn)量有影響，目前已觀察到在B.subtilis中存在鐵離子和錳離子的主動(dòng)運(yùn)輸系統(tǒng)，二者在生物合成過程中參與了酶的合成。此外，Kinsinger等［32］研究表明B.subtilis內(nèi)用于激活抗菌脂肽合成的PCP區(qū)域的Sfp蛋白活性位點(diǎn)需要Mg2＋作為輔助因子，因此Mg2＋在抗菌脂肽合成中至關(guān)重要。對(duì)比結(jié)果，選擇8號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖5 不同培養(yǎng)基對(duì)K－19產(chǎn)surfactin的影響

2.4 發(fā)酵最佳時(shí)間的確定

由圖6可知，surfactin產(chǎn)量隨著菌體細(xì)胞的增加而增加，16～42 h大量、快速合成，42 h時(shí)達(dá)到最大值，之后略有下降。發(fā)酵液的抑菌圈直徑與surfactin含量變化呈正相關(guān)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，surfactin產(chǎn)量逐漸增加，發(fā)酵液對(duì)根腐病病原菌的抑菌性逐漸增加。綜合考慮，選擇42 h為菌株K－19的最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖6 K－19菌株surfactin的合成曲線

2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

由圖7可知，發(fā)酵溫度35℃時(shí)surfactin產(chǎn)量最高。溫度對(duì)微生物代謝產(chǎn)物合成具有重要影響，溫度過高或是過低都不利于菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。溫度較低時(shí)，菌體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致發(fā)酵周期延長(zhǎng)；溫度過高時(shí)，又會(huì)影響菌體代謝中某些酶的活性，不利于surfactin合成。因此，發(fā)酵溫度選擇35℃。

圖7 溫度對(duì)surfactin產(chǎn)量的影響

由圖8可知，K－19菌株在pH為5～8范圍內(nèi)均能產(chǎn)生surfactin，當(dāng)pH＝7時(shí)產(chǎn)量最高。由圖9可知，在相同條件下，隨著轉(zhuǎn)速的增加，surfactin產(chǎn)量總體呈上升趨勢(shì)，160 r／min下surfactin的產(chǎn)量最高。超過160 r／min后，呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)檠挎邨U菌是好氧性細(xì)菌，溶氧量對(duì)菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝有重要影響。轉(zhuǎn)速增高時(shí)，會(huì)增加培養(yǎng)液中的溶氧量，有利于菌體生長(zhǎng)代謝；而轉(zhuǎn)速過高不利于surfactin合成。

圖8 pH值對(duì)surfactin產(chǎn)量的影響

圖9 轉(zhuǎn)速對(duì)surfactin產(chǎn)量的影響

綜上，菌株K－19產(chǎn)surfactin的最佳發(fā)酵條件為рН＝7、發(fā)酵溫度35℃、轉(zhuǎn)速160 r／min，在此條件下，合成surfactin的產(chǎn)量可達(dá)1.40 g／L。

3 討論與結(jié)論

本研究分離篩選得到的菌株發(fā)酵液排油圈直徑和surfactin產(chǎn)量有一定的相關(guān)性，且這些菌株不全具有溶血性。這與龔谷迪等［27］的結(jié)論不一致。通過本研究可以看出，排油性為產(chǎn)surfactin菌株的典型特征，而溶血性為非典型特征。因此，用溶血圈法進(jìn)行初篩有一定的弊端，可能會(huì)漏掉產(chǎn)抗菌脂肽較好的菌株。本研究通過多種方法結(jié)合篩選得到一株高產(chǎn)脂肽類表面活性素surfactin的貝萊斯芽孢桿菌，彌補(bǔ)了用單一方法進(jìn)行菌株篩選的不足。

抗菌脂肽一般由多種同系物組成，其產(chǎn)生受環(huán)境的影響很大，其中培養(yǎng)基是重要的影響因素［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，最有利于貝萊斯芽孢桿菌K－19產(chǎn)生surfactin的培養(yǎng)基成分為豆粕40 g／L、葡萄糖9 g／L、MgSO40.2 g／L、MnSO42.5 mg／L、FeSO40.8 mg／L、L－谷氨酸3 mg／L，最佳培養(yǎng)條件為рН ＝7、發(fā)酵溫度35℃、轉(zhuǎn)速160 r／min，在此條件下發(fā)酵培養(yǎng)42 h，貝萊斯芽孢桿菌K－19合成surfactin的產(chǎn)量可達(dá)1.40 g／L。

大量研究表明，脂肽類表面活性劑在芽孢桿菌的生物防治過程中起著重要的作用［7］。貝萊斯芽孢桿菌K－19發(fā)酵周期短，易產(chǎn)生脂肽類表面活性劑，對(duì)多種植物病原菌有很好的抑制作用，因此該菌株具有進(jìn)一步開發(fā)、生產(chǎn)抗菌脂肽及生物防治產(chǎn)品的潛力。