張楊子 王璇 吳珇彤 潘淑惠 文正常 文明

（1，貴州省畜牧獸醫(yī)研究所 550001；2，貴州大學 550001）

鴨病毒性腸炎（DVE）指的是鴨腸炎病毒（DEV）引發(fā)的禽類急性、熱性、敗血性傳染疾病，以往在多個國家流行，其給養(yǎng)鴨業(yè)造成了相當大的經濟損失[1]。絲切蛋白（Cofilin）為一類低分子量肌動蛋白結合蛋白物質，其廣泛存在于真核生物內。Cofilin 具體的活性會受到諸多因素調節(jié)，體現(xiàn)出與之相關的作用。結合實際情況，本文全面探究Cofifilin 在鴨腸炎病毒感染過程中的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

試驗應用的受精鴨蛋購買自某地養(yǎng)殖場。選擇國家動物疫病研究室內提供的鴨腸炎病毒G Z 株為病毒菌株。自中國上海吉瑪生物有限公司購買pGPH1/GFP/Neo-shNC 表達質粒。本試驗所使用的試劑為胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶、Penicillin streptomyin、Lipofectamine3000。試驗所使用的主要儀器：倒置型熒光相差顯微鏡及與之相關成像系統(tǒng)、孵化機。

1.2 方法

1.2.1 Cofilin-shRNA 提取

首先，依照測序得出的鴨源的-Cofilin2 基因全序列，應用在線軟件，選擇鴨源Cofilin2RNA 的相關干擾性靶點，設計出相關干擾序列，送到中國上海吉瑪生物有限公司完成合成工作。在shRNA 模板內的loop 結構擇取TTCAAGAGA，以防止生成終止性信號，運用T6 結構為RNA 轉錄終止序列。并于正義鏈模板5’ 端增添CACC，保證其和BbsI 酶切后生成粘端互補。并在反義鏈5’ 端增加GATC。若siRNA 首個堿基并非G，有必要于CACC 后增加G。同時設立陰性對照小組。然后，試驗應用ddH2O，把已經合成完畢的寡聚單鏈DNA 溶解為100μm/L。在互補型單鏈之內分別取用5μl，雙雙混合，并加入共計2μl 的10×oilgo annealing buffer。加入純凈水，直至20μl為止。此后把以上物質加熱到95℃，共計5min。室溫冷卻，最終生成雙鏈樣DNA，此后稀釋為10nM/L 的溶液。依照相關次序，分 別加5×ligation buffer、pGPH1/GFP/Neo、ds-oligo 及T4DNAliase。加入純凈水，直至20μl，并在室溫環(huán)境下放置0.5h。最后，選擇10μl 的連接產物，全面轉化感受態(tài)細胞DH5α。將其涂抹在含有壯觀霉素的LB 平板中，將其放入37℃環(huán)境下過夜。將單克隆菌落接種在內含壯觀霉素LB 培養(yǎng)基內恒溫過夜，提取質粒。將其送到有資質公司內完成測序工作。

1.2.2 Cofilin-shRNA 相關篩選

首先，重組質粒轉染DEF 原代細胞，具體為提取重組質粒、制備DEF 原代細胞及重組質粒轉染。然后在轉染24h 后應用顯微鏡查看GFP 表達詳情及細胞生長詳情。目的在于實施miRNA 的篩選工作。最后，應用FQ-PCR 測定細胞Cofifilin 基因轉錄水平。在轉染完畢24 h 后收集好細胞，并提取總RNA后開展反轉錄工作，制作成cDNA，實施CofifilinFQPCR 測定出共計4 小對miRNA 的影響效果詳情。

2 結果

2.1 Cofilin-shRNA 染色表達結果

培養(yǎng)所得的DEF 細胞表現(xiàn)為單層后，實施轉染RNA 對質粒加以干擾。24h 內查看重組質粒轉染詳情。結果表明細胞生長滿意，因重組質粒內包含GFP 基因，所以被轉入細胞顯示出綠色熒光，證實轉染重組質粒試驗成功。

2.2 Cofilin-shRNA 影響觀察結果

每個小組均可以測得Cofilin 基因。空白組Cofilin 水平峰值為1。陰性組實際含量水平高于質粒小組，但比空白組低。轉染后重組質粒Cofilin-shRNA-304 及86 后細胞的轉錄水平比空白小組低。Cofilin-shRNA451、247 細胞的Cofilin 轉錄水平比空白組低，但并不明顯。在此其中Cofilin-shRNA86 經處理后細胞內部Cofilin 轉錄量最小，其沉默效果峰值達到54.03%，表示其針對于細胞的Cofifilin 沉默效果最為優(yōu)秀，可以供給后續(xù)試驗應用。

2.3 Cofilin-shRNA 干擾下DEV 增值動態(tài)詳情

轉染處理后RNA 干擾質粒后相關時間段內Cofilin mRNA檢測結果，見表1。轉染靶向miRNA 后感染DEV 動態(tài)性測定DEV 核酸水平，見表2。

表1 轉染處理后RNA 干擾質粒后相關時間段內Cofilin

表2 轉染靶向miRNA 后感染DEV 動態(tài)性測定DEV 核酸水平

3 討論與結論

就Cofilin 具體功能分析，Cofilin 能和肌動蛋白絲及肌動蛋白單體相互結合體現(xiàn)出作用[2]。其于細胞中結合肌動蛋白絲主要通過內部不穩(wěn)定性解聚加以實現(xiàn)。同時，其也能有效抑制肌動蛋白單體聚合，加大激動蛋白絲翻轉。相關調查表明，Cofilin 為細胞運動能力調控過程中的重要因素之一，其能有效維持細胞極性和具體形態(tài)，加速胞質分裂，促進細胞游走及運動，參加到胚胎的血管新生、發(fā)育、器官形成和腫瘤轉移等功能中[3]。

在所有生物調節(jié)過程內，轉錄調控均顯得格外重要。應用RNA 干擾技術能以特異性的方式抑制特定化基因表達，其屬于一類快捷且高效的分析基因功能工具。本組試驗研究結果表明，通過熒光顯微鏡收集圖像分析，4 組質粒成功轉染且順利表達。

其中沉默率最高為Cofifilin-shRNA-86。86 對DEF 細胞轉染處理后48～120h 沉默效率在42.6%～56.2%之間。其在轉染DEF 細胞24h 后感染DEV，測定出DEV 在轉染后24～96h 過程中的核酸量比轉染DMEM 組更低。DEV 感染小組及正常小組各個組織Cofilin2 基因于相同時間點轉錄變化一致性強。其在相同組織各個時間段轉錄改變沒有體現(xiàn)出規(guī)律。篩選獲取沉默效應顯著的Cofilin shRNA-86。經干擾宿主處理細胞Cofilin2 基因表達情況，表明其能達到促進DEV 增殖的效果。