孫發(fā)鑫,許曉蒙,馮瑩瑩,郭文娜,袁 夢(mèng),李志勇,許 卉

(煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),山東 煙臺(tái) 264005)

臨床肺炎多為致病菌感染所致,肺炎克雷伯菌感染的危險(xiǎn)性尤為嚴(yán)重。臨床上常用碳青霉烯類、大環(huán)內(nèi)酯類、頭孢菌素類及青霉素類抗生素治療肺炎克雷伯菌感染[1]。阿奇霉素(AZM)是目前治療細(xì)菌性肺炎的一線藥物,具有廣譜抑菌作用和顯著的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用[2-3]。AZM在體內(nèi)吸收迅速,達(dá)峰時(shí)間短,半衰期長(zhǎng),生物利用度高,分布廣泛,組織濃度明顯高于同期血藥濃度[4]。然而,AZM存在明顯的副作用,如胃腸不適、過(guò)敏、免疫紊亂、肝損傷和神經(jīng)系統(tǒng)損傷,從而限制了AZM的臨床療效[5-6]。研究發(fā)現(xiàn),包括AZM在內(nèi)的抗生素與常見(jiàn)清熱解毒類中藥制劑聯(lián)用,如痰熱清注射液、熱毒寧注射液、喜炎平注射液[7-9],既清除患者體內(nèi)致病微生物,又降低藥物的不良反應(yīng),臨床效果評(píng)價(jià)頗高。

苦木注射液(KM)是由苦木干燥枝或莖制成的,為橙黃色的澄明液體,具有清熱、解毒、消炎功效,常用于感冒、上呼吸道感染、急性扁桃體炎、細(xì)菌性痢疾等的治療[10-11]。目前臨床上KM與化學(xué)抗生素聯(lián)用還存在空白。本實(shí)驗(yàn)以肺炎克雷伯菌構(gòu)建模型,建立一種靈敏、高效、快速的LC-MS/MS分析方法測(cè)定大鼠血漿和組織中AZM的濃度,考察苦木注射液對(duì)阿奇霉素在大鼠體內(nèi)組織分布的影響,為臨床苦木注射液與阿奇霉素聯(lián)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及動(dòng)物

Agilent 1100高效液相色譜儀;Thremo TSQ Quantum Access三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀;TGL-20W臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司);實(shí)驗(yàn)室注射泵TYD02-04-CE(保定雷弗流體科技有限公司);XS-105型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO)。

苦木注射液(江西青峰藥業(yè)有限公司),批號(hào):2016072303;注射用阿奇霉素(山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)有限公司),批號(hào):518013152;阿奇霉素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院),批號(hào):130593-201303;阿霉素(北京偶合科技有限公司);肺炎克雷伯標(biāo)準(zhǔn)菌株[CMCC(B)46117;中國(guó)食品藥品檢定研究院];甲醇、乙腈均為色譜純;其余試劑均為市售分析純;實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

健康雄性SD大鼠12只,體重(200±20)g,濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)合格證書:SCXK(魯)2014-0007],實(shí)驗(yàn)前1周進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)。動(dòng)物相關(guān)的所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)煙臺(tái)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 AZM標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱取阿奇霉素對(duì)照品1.05 mg,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得質(zhì)量濃度為0.105 mg/mL的儲(chǔ)備液。放置4 ℃貯藏,備用。

阿霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱取阿霉素對(duì)照品5.07 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定溶,得質(zhì)量濃度為507 μg/mL的儲(chǔ)備液,再逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為250 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液,備用。

1.2.2 大鼠細(xì)菌感染性肺炎模型建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SD雄性大鼠,采用氣管注入法建立大鼠肺炎模型[12-13]。將大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)使其麻醉,滴入0.05 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺炎克雷伯菌(4×107CFU/mL),接種后立即豎立于固定臺(tái),保持直立位約20 s,以保證接種菌液受重力作用流入支氣管和肺泡內(nèi)進(jìn)行肺部感染。造模前大鼠全血中白細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的數(shù)目分別為(8.61±1.11)×109個(gè)/L、(3.02±1.27)×109個(gè)/L,造模后全血中白細(xì)胞數(shù)目及中性粒細(xì)胞數(shù)分別為(22.07±5.32)×109個(gè)/L、(15.55±3.92)×109個(gè)/L,顯著增加2.6倍和5.1倍,肺組織經(jīng)HE染色顯示有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),表明造模成功。

1.2.3 動(dòng)物分組與給藥方案 造模成功的大鼠給藥處理前禁食不禁水12 h,稱重、編號(hào)后隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(n=6)。對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注射AZM,實(shí)驗(yàn)組以同樣方式給予AZM和KM,劑量均為75 mg/mL,每日1次,連續(xù)給藥1周。

1.2.4 血漿樣品采集與預(yù)處理 末次給藥24 h后,斷尾取血0.5 mL于肝素化EP管中,輕輕振搖,4 ℃下離心10 min(8000 r/min),移取上清液于潔凈EP管中,-20 ℃保存。

取血漿50 μL至EP管中,加入內(nèi)標(biāo)溶液(250 ng/mL)50 μL、0.02 mol/L Na2CO3300 μL和乙酸乙酯-異丙醇(95∶5)2 mL,渦旋混合2 min,4 ℃下離心10 min(12 500 r/min)。取上清液至潔凈EP管中,37 ℃水浴中氮?dú)饬鞔蹈?加入流動(dòng)相200 μL復(fù)溶,渦旋離心,取上清5 μL,進(jìn)樣檢測(cè)。

1.2.5 組織樣品采集與預(yù)處理 末次給藥24 h后,脫頸椎處死大鼠,取出心、肝、脾、肺、腎,用生理鹽水洗凈組織表面浮血,濾紙吸干殘余液體,稱重,-20 ℃保存待測(cè)。

精密稱取組織樣品置勻漿機(jī)中,按照質(zhì)量∶體積為1∶5的比例加入純水,充分勻漿,4 ℃離心10 min(3600 r/min),取組織勻漿上清液50 μL至EP管中,依次加入內(nèi)標(biāo)溶液(250 ng/mL)50 μL、0.02 mol/L Na2CO3300 μL和乙酸乙酯-異丙醇(95∶5)2 mL,渦旋混合2 min,4 ℃離心10 min(12 500 r/min)。取上清液至潔凈EP管中,37 ℃水浴中氮?dú)饬鞔蹈?加入流動(dòng)相200 μL復(fù)溶,渦旋離心,取上清5 μL,進(jìn)樣檢測(cè)。

1.2.6 色譜條件 色譜柱:WATERS, ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1×50 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:0.1%甲酸水-乙腈(30∶70);柱溫:30 ℃;流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:2 μL。

1.2.7 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),正離子方式檢測(cè),掃描方式為單反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM),用于定量分析的離子反應(yīng)分別為AZMm/z749.20→591.04、內(nèi)標(biāo)阿霉素m/z543.90→396.61,離子噴射電壓4 kV,毛細(xì)管溫度350 ℃,鞘氣壓力30 psi,輔助氣壓力5 psi,AZM和內(nèi)標(biāo)的碰撞能量(CE)分別為35、17 eV。

1.2.8 方法學(xué)考察 參考中國(guó)藥典(2015版)生物樣品定量分析方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則以及文獻(xiàn)[14-16],進(jìn)行了方法學(xué)考察,主要包括專屬性、線性范圍和定量下限、精密度及準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性 取空白血漿和組織勻漿、含AZM和內(nèi)標(biāo)的空白血漿和組織勻漿以及給藥后的大鼠血漿和組織勻漿,按“1.2.4”和“1.2.5”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,血漿和組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾AZM的測(cè)定,方法的專屬性良好(圖1,僅以肝為例)。

圖1 LC-MS/MS測(cè)定大鼠肝中AZM濃度的典型色譜圖

2.1.2 線性范圍與定量下限 取空白血漿制成含AZM質(zhì)量濃度分別為0.1,1,10,20,50,100 ng/mL的系列樣品,加入內(nèi)標(biāo)(250 ng/mL)50 μL,按“1.2.4”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定,記錄色譜圖,以待測(cè)藥物濃度為橫坐標(biāo),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo),用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得回歸方程。結(jié)果表明:血漿中AZM在0.1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.995 4),最低定量濃度為0.1 ng/mL。

表1 血漿和組織中AZM測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

取空白組織勻漿制成含AZM質(zhì)量濃度分別為1,10,20,50,100,200,500 ng/mL的系列樣品,加入內(nèi)標(biāo)(250 ng/mL)50 μL,按“1.2.5”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定,記錄色譜圖,以待測(cè)藥物濃度為橫坐標(biāo),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo),用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算得回歸方程。結(jié)果表明:脾、肺、腎組織中AZM測(cè)定的線性濃度范圍為1～100 ng/mL,肝、心組織中AZM測(cè)定的線性濃度范圍分別為1～500 ng/mL和1～200 ng/mL(r>0.99),各組織的最低定量限均為1 ng/mL。

2.1.3 精密度與準(zhǔn)確度 按樣品處理方法平行制備低、中、高質(zhì)量濃度含藥血漿和組織質(zhì)控樣品各9份(n=3份/批×3批),進(jìn)樣檢測(cè)后計(jì)算日間、日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度,結(jié)果見(jiàn)表2。測(cè)定結(jié)果表明:低、中、高質(zhì)量濃度AZM測(cè)定的日內(nèi)、日間精密度(RSD)均小于10.8%,準(zhǔn)確度(RE)均小于10.1%,滿足生物樣品定量分析方法要求。

表2 AZM在血漿和組織中的精密度和準(zhǔn)確度

2.1.4 回收率與基質(zhì)效應(yīng) 按樣品處理方法制備低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品,進(jìn)樣檢測(cè)后的目標(biāo)分析物的峰面積為A;將空白血漿和組織勻漿按樣品處理方法進(jìn)行預(yù)處理,再加入AZM和內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析,得到目標(biāo)分析物的峰面積B;制備相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,得目標(biāo)分析物的峰面積C。以“(A/B)×100%”計(jì)算提取回收率,以“(B/C)×100%”考察基質(zhì)效應(yīng)。由表3可見(jiàn),AZM在大鼠血漿和組織中的回收率均大于80%且無(wú)明顯的基質(zhì)效應(yīng),符合生物樣品定量分析的要求。

表3 AZM在血漿和組織中的回收率和基質(zhì)效應(yīng)

表3(續(xù))

2.1.5 穩(wěn)定性 取空白大鼠血漿和組織勻漿,分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制質(zhì)控樣品,考察樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器放置24 h、室溫放置2 h、3次凍融循環(huán)及在-20 ℃下放置14 d的穩(wěn)定性,每種條件下每濃度3個(gè)平行樣本。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示,AZM在不同條件下的RSD均小于9.7%,表明血漿和組織樣品的AZM在上述條件下均具有良好的穩(wěn)定性。

表4 不同條件下AZM在血漿和組織中的穩(wěn)定性

2.2 組織分布研究

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,血漿和各組織中的AZM濃度均遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍,因此對(duì)血漿和組織勻漿進(jìn)行稀釋,血漿稀釋5 000倍,心稀釋2 000倍,肝稀釋10 000倍,脾、肺、腎均稀釋20 000倍。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠體內(nèi)各組織中AZM的濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組AZM在心和肝中的藥物濃度顯著降低(P<0.05),在血漿和其他組織中未見(jiàn)有顯著性差異。研究結(jié)果表明,KM與AZM聯(lián)用可能加快了AZM在肺炎大鼠心和肝中的代謝,從而降低心和肝中的藥物蓄積,有利于減輕AZM的不良反應(yīng)。

與對(duì)照組相比,*P<0.05。

3 討 論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),AZM與KM聯(lián)用對(duì)肺炎克雷伯菌具有顯著的抑菌效果,因此本研究選取肺炎克雷伯菌造模,并給予模型大鼠同等劑量的AZM和/或KM。藥效學(xué)研究結(jié)果表明,AZM聯(lián)合KM對(duì)大鼠肺組織炎癥的治療效果最強(qiáng)。AZM在靜脈注射給藥吸收后具有高度的組織選擇性和細(xì)胞滲透性的特點(diǎn),脾、肝、肺和腎中的分布尤為明顯,其在組織中的藥物濃度明顯高于血漿,這與文獻(xiàn)報(bào)道是一致的[17]。由于AZM本身單劑量給藥后血漿代謝消除半衰期長(zhǎng)達(dá)35～38 h,且排泄較慢,有較強(qiáng)的抗生素后效應(yīng),加之較長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)用藥,使AZM的組織濃度增加,產(chǎn)生蓄積,增加肝損害的風(fēng)險(xiǎn)。因此本實(shí)驗(yàn)將肺炎大鼠單用AZM及AZM聯(lián)合KM給藥后在各組織的AZM含量進(jìn)行比較,結(jié)果顯示在各組織中,聯(lián)合給藥組的AZM含量均低于AZM單藥組,并在心和肝中顯著降低,表明KM可以加快AZM在各組織中的代謝消除,避免AZM在體內(nèi)蓄積造成肝臟損害。

4 結(jié) 論

本研究建立并驗(yàn)證了測(cè)定大鼠血漿和組織中AZM濃度的LC-MS/MS方法,方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果均符合生物樣品分析指導(dǎo)原則的要求,通過(guò)比較AZM單用和AZM聯(lián)用KM后AZM在肺炎大鼠不同組織的分布差異,發(fā)現(xiàn)AZM與KM聯(lián)用顯著降低AZM在心和肝臟中的藥物蓄積,加速AZM在體內(nèi)的代謝,提高療效的同時(shí)減少不良反應(yīng)的發(fā)生,為臨床AZM聯(lián)合用藥提供更多選擇。