岳佑凇，張 璐，謝夢(mèng)迪，王柯涵，張 璞，張慧杰，王艷麗，桂新景, 3, 4，施鈞瀚, 3, 4，姚 靜, 3, 4，劉瑞新, 3, 4*，李學(xué)林, 3, 4*

茯苓傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑化學(xué)成分的對(duì)比研究

岳佑凇1，張 璐2，謝夢(mèng)迪1，王柯涵2，張 璞1，張慧杰1，王艷麗2，桂新景2, 3, 4，施鈞瀚2, 3, 4，姚 靜2, 3, 4，劉瑞新2, 3, 4*，李學(xué)林2, 3, 4*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450000 3. 河南省中藥飲片臨床應(yīng)用現(xiàn)代化工程研究中心，河南 鄭州 450000 4. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450000

以茯苓為研究對(duì)象，進(jìn)行其飲片傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑化學(xué)成分上的對(duì)比研究，為茯苓配方顆粒的臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。選擇15批不同產(chǎn)地或批次的茯苓飲片及5個(gè)廠家各3批配方顆粒，基于HPLC法建立二者湯劑指紋圖譜，從三萜類化學(xué)成分種類、三萜類指標(biāo)性成分含量、所有峰峰面積總和3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，并使用主成分分析（PCA）法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。三萜類化學(xué)成分種類：茯苓飲片傳統(tǒng)湯劑中未檢測(cè)到三萜類指標(biāo)性成分，而多數(shù)廠家配方顆粒湯劑中有3個(gè)以上的三萜類指標(biāo)性成分；1個(gè)廠家與傳統(tǒng)湯劑類似，未檢測(cè)到上述成分；三萜類指標(biāo)性成分含量：各廠家茯苓配方顆粒湯劑在三萜類指標(biāo)性成分含量方面差異較大；A、C、D、E 4個(gè)含有指標(biāo)性成分的配方顆粒廠家產(chǎn)品中，D廠和E廠的多數(shù)成分相對(duì)較高，A廠各成分相對(duì)均衡，而C廠部分指標(biāo)性成分缺失；所有峰峰面積總和：將D廠配方顆粒湯劑中所有峰峰面積總和定為100%，相較于D廠，傳統(tǒng)湯劑為3.90%、A廠12.38%、B廠1.97%、C廠10.47%、E廠8.57%；主成分分析結(jié)果表明，同一廠家不同批次間質(zhì)量不一，C廠最為集中，A廠相對(duì)集中，D、E廠3個(gè)批次間分布最分散。茯苓飲片傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑在三萜類成分種類上具有非常明顯的差異，各廠家茯苓配方顆粒湯劑中三萜類成分的種類、含量和批次間穩(wěn)定性也不盡一致，提示各廠家配方顆粒制備工藝不盡相同，應(yīng)進(jìn)一步深入探討茯苓配方顆粒的制備工藝及其合理應(yīng)用，同時(shí)對(duì)茯苓飲片的合理使用也應(yīng)進(jìn)一步深入研究。

茯苓；傳統(tǒng)湯劑；配方顆粒；HPLC；三萜；主成分分析

中藥傳統(tǒng)湯劑（traditional decoction，TD）具有隨證加減的優(yōu)勢(shì)，是我國(guó)應(yīng)用最早、最廣泛的劑型[1]。中藥配方顆粒（dispensing granule of Chinese medicine，DGCM）是應(yīng)用現(xiàn)代制藥技術(shù)將傳統(tǒng)中藥飲片經(jīng)過(guò)提取、濃縮、干燥、制粒、包裝而成的顆粒狀物質(zhì)，臨方調(diào)配成湯劑后即成中藥配方顆粒湯劑（dispensing granule decoction，DGD）[2]。它在保證了傳統(tǒng)湯劑隨證加減的基礎(chǔ)上，規(guī)避了傳統(tǒng)湯劑攜帶不便、服用量大等缺點(diǎn)，一定程度上推動(dòng)了劑型改革創(chuàng)新的進(jìn)程，促進(jìn)了中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展。自1987年提出改革和研究，到2019年《關(guān)于中藥配方顆粒品種試點(diǎn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的公示》（以下簡(jiǎn)稱為《公示》）的發(fā)布，涉及生產(chǎn)配方顆粒的藥企幾十家，歷經(jīng)30余年發(fā)展，足以彰顯其重要程度[3]。2021年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)國(guó)家醫(yī)保局發(fā)布了關(guān)于結(jié)束中藥配方顆粒試點(diǎn)工作的公告，該公告自2021年11月1日起施行，預(yù)示著配方顆粒的生產(chǎn)應(yīng)用將得到進(jìn)一步發(fā)展。

但目前因中藥成分復(fù)雜，大多數(shù)中藥仍缺乏科學(xué)、統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)企業(yè)各自為政，按照自己制定的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，其成分及藥效是否穩(wěn)定，是否與傳統(tǒng)湯劑藥效保持一致，依然是亟待深入研究的重點(diǎn)方向。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局在綜合了生產(chǎn)單位、臨床使用單位、醫(yī)生、患者的意見反饋后先后于2015年12月30日、2020年1月4日下發(fā)了《中藥配方顆粒管理辦法（征求意見稿）》[4]。而本課題組前期也對(duì)黃連、黃柏單味飲片，當(dāng)歸補(bǔ)血湯等[5-7]經(jīng)典藥對(duì)及復(fù)方的傳統(tǒng)湯劑及其配方顆粒湯劑進(jìn)行了基于HPLC指紋圖譜的對(duì)比研究，獲取了單味飲片及復(fù)方的傳統(tǒng)湯劑及其配方顆粒湯劑間的差異規(guī)律，指導(dǎo)臨床合理用藥并初見成效，但對(duì)菌類、礦物、動(dòng)物、毒物、貴重等特殊類別的單味中藥配方顆粒的研究還涉及較少，且就整體研究領(lǐng)域而言較少檢索到有關(guān)于上述特殊類別的單味中藥配方顆粒的研究?jī)?nèi)容，國(guó)家藥典委員會(huì)下發(fā)的《公示》中，160個(gè)中藥品種僅涉及一種菌類中藥?kù)`芝，因此本實(shí)驗(yàn)先從菌類中藥著手，以茯苓為研究對(duì)象，開展配方顆粒湯劑與傳統(tǒng)湯劑間的對(duì)比研究。

茯苓被稱為“四時(shí)神藥”[8]，在《神農(nóng)本草經(jīng)》上被列為上品，為多孔菌科真菌茯苓(Schw.) Wolf的干燥菌核，是臨床應(yīng)用最為廣泛的中藥之一，有“十方九苓”之說(shuō)[9]，具有利水滲濕、健脾、寧心的功效，可用于水腫尿少、脾虛食少、心神不安等[10]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，茯苓具有利尿、抗炎、抗癌、腫瘤抑制及增強(qiáng)免疫的作用[11-13]。茯苓中的三萜類及多糖是其主要活性物質(zhì)[14-15]，其中茯苓三萜類具有較強(qiáng)的利水、抗癌和調(diào)節(jié)免疫作用[16-17]。為深入對(duì)菌類中藥傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑間的對(duì)比研究，研究組將收集到的各15批次的茯苓飲片及茯苓配方顆粒，采用HPLC法建立指紋圖譜，對(duì)比茯苓傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑的異同。旨在為特殊類別中藥配方顆粒的一致性評(píng)價(jià)以及臨床合理用藥，提供更科學(xué)、合理的數(shù)據(jù)參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

FA2004B萬(wàn)分之一電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；CP225D十萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)Sartorius公司；Agilent1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Agilent G4212-60008外檢測(cè)ChemstationA.01.04色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科技儀器廠）；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MP-201隔膜真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 試藥

對(duì)照品茯苓新酸A（批號(hào)CHB190211）、茯苓新酸B（批號(hào)CHB180731）、去氫茯苓酸（批號(hào)CHB180109）、松苓新酸（批號(hào)CHB190216）均來(lái)源于成都克洛瑪生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；對(duì)照品去氫土莫酸，批號(hào)Z25J10S93909，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%，上海源葉生物科技有限公司；對(duì)照品豬苓酸C，批號(hào)ST20170205，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%，上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司；娃哈哈純凈水。

1.3 樣品

15批茯苓飲片分別購(gòu)自于鄭州5家中醫(yī)院和3家藥店，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳天朝主任藥師鑒定均為(Schw.) Wolf的干燥菌核的炮制品。茯苓配方顆粒分別購(gòu)自于四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司、華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司、江陰天江藥業(yè)有限公司、北京康仁堂藥業(yè)有限公司、廣東一方制藥有限公司5個(gè)生產(chǎn)企業(yè)，以下用A、B、C、D、E廠代表，茯苓飲片及配方顆粒信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 茯苓飲片與茯苓配方顆粒指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent 5 HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～20 min，45%～52%乙腈；20～40 min，52%～55%乙腈；40～60 min，55%～70%乙腈；60～70 min，70%～100%乙腈；70～80 min，100%乙腈；80.01～90 min，45%乙腈；體積流量0.8 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm；進(jìn)樣量20 μL；理論塔板數(shù)以去氫茯苓酸的峰面積計(jì)算≥6 000。

表1 茯苓飲片及配方顆粒樣品信息

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

（1）去氫茯苓酸對(duì)照品溶液：精密稱取去氫茯苓酸對(duì)照品適量，用甲醇溶解，分別制得含去氫茯苓酸0.354、0.177 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

（2）混合對(duì)照品溶液：分別精密稱量茯苓酸A、茯苓酸B、去氫茯苓酸、去氫土莫酸、豬苓酸C、松苓新酸對(duì)照品，加甲醇溶解，配制成含有茯苓酸A 0.112 mg/mL、茯苓酸B 0.109 mg/mL、去氫茯苓酸0.101 mg/mL、去氫土莫酸0.105 mg/mL、豬苓酸C 0.108 mg/mL、松苓新酸0.110 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

（1）茯苓飲片醇提供試品溶液：分別精密稱量f1～f15茯苓飲片粉末（過(guò)四號(hào)篩）各5 g，加25 mL 95%乙醇至錐形瓶中，精密稱定，超聲45 min，后放置至室溫并補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，濾過(guò)，量取濾液15 mL并蒸干，用95%乙醇溶解并定容至5 mL量瓶中，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得茯苓飲片醇提供試品溶液，分別標(biāo)記為S1～S15。

（2）茯苓配方顆粒醇提供試品溶液：依次稱量各廠家配方顆粒294.1、500.0、500.0、2 994.0、250.0 mg（均相當(dāng)于茯苓飲片5 g），按照上述方法制備茯苓配方顆粒醇提供試品溶液，分別標(biāo)記為DGCM1～DGCM15。

2.1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

（1）精密度試驗(yàn)：精密吸取S1樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.05%～0.20%，相對(duì)峰面積RSD在0.85%～2.15%；去氫茯苓酸保留時(shí)間的RSD為0.07%，峰面積RSD為0.91%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取S1供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、48 h按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.06%～0.21%，相對(duì)峰面積RSD在0.86%～1.95%；去氫茯苓酸保留時(shí)間的RSD為0.07%，峰面積RSD為0.86%，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（f1），按照按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.06%～0.21%，相對(duì)峰面積RSD在1.10%～1.70%；去氫茯苓酸保留時(shí)間的RSD為0.07%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.86%，表明該方法重復(fù)性良好。

（4）加樣回收率試驗(yàn)：精密量取已測(cè)定指標(biāo)成分含量的S1樣品6份，每份2.5 g，精密加入去氫茯苓酸0.632 mg/mL對(duì)照品溶液1 mL，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果去氫茯苓酸的平均回收率為102.94%，RSD為0.13%。

（5）線性關(guān)系考察：精密吸取去氫茯苓酸對(duì)照品溶液，制得質(zhì)量濃度分別為354、177、44、11、2.8、0.17 μg/mL的對(duì)照品溶液。取上述系列對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣20 μL，以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為＝31 979＋6.310 5，＝0.999 9，結(jié)果表明去氫茯苓酸在0.17～354 μg/mL與其峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 茯苓飲片與配方顆粒HPLC指紋圖譜建立

（1）對(duì)照品HPLC色譜圖：吸取“2.1.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，混合對(duì)照品的HPLC色譜圖見圖1-a。

（2）茯苓飲片HPLC指紋圖譜：取“2.1.3”項(xiàng)下15批茯苓飲片醇提供試品，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，構(gòu)建HPLC指紋圖譜。共有19個(gè)共有峰，結(jié)果見圖1-b。

（3）茯苓配方顆粒HPLC指紋圖譜：取“2.1.3”項(xiàng)下15批茯苓配方顆粒醇提供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件檢測(cè)，記錄色譜圖，構(gòu)建HPLC指紋圖譜。因產(chǎn)自B廠的編號(hào)為4～6批次的配方顆粒醇提供試品未檢出特征峰，因此構(gòu)建指紋圖譜時(shí)將該3個(gè)批次剔除，其他13個(gè)批次色譜圖構(gòu)建指紋圖譜，共有4個(gè)共有峰，結(jié)果見圖1-c。

2.2 茯苓飲片TD與茯苓DGD指紋圖譜的建立

2.2.1 茯苓飲片TD與茯苓DGD的制備

（1）茯苓飲片TD的制備：為反映真實(shí)世界中傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒的差距所在，經(jīng)小組對(duì)傳統(tǒng)湯劑的制備指導(dǎo)原則的調(diào)研結(jié)果，特將本實(shí)驗(yàn)中傳統(tǒng)湯劑的制備方法確定為由3位不同的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行傳統(tǒng)湯劑的制備。分別取約200 g的茯苓飲片按照傳統(tǒng)的煎藥方法進(jìn)行樣品的制備，合并兩次煎藥液，濾布濾過(guò)，放冷，定容至1000 mL，混勻，即得，備用。

（2）茯苓DGD的制備：依次精密稱量各廠家配方顆粒294.1、500.0、500.0、299.4、250.0 mg（均相當(dāng)于茯苓飲片5 g），加20 mL熱水使溶解，放至冷卻，用水定容至25 mL，攪拌混勻使其全部溶解，放冷，即得，備用。

2.2.2 茯苓TD供試品溶液與茯苓DGD供試品溶液的制備

（1）茯苓TD供試品溶液的制備：精密量取10 mL“2.2.1”項(xiàng)下茯苓TD溶液至25 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇定容至25 mL，混勻，靜置，取上清液過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，即得，標(biāo)記為TD1～TD15。

（2）茯苓DGD供試品溶液的制備：精密量取10 mL “2.2.1”項(xiàng)下制備所得茯苓DGD溶液至25 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇定容至25 mL，混勻，靜置，取上清液過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，即得，標(biāo)記為DGD1～DGD15。

2.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

（1）精密度試驗(yàn)：精密量取DGD9供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定。結(jié)果，各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯變化，RSD集中在0.11%～0.32%；相對(duì)峰面積RSD集中在1.66%～3.88%；去氫茯苓酸保留時(shí)間的RSD值為0.11%，峰面積的RSD為2.72%，結(jié)果表明方法精密度良好。

6-茯苓酸B 8-茯苓酸A 9-去氫土莫酸 11-豬苓酸C 13-去氫茯苓酸 14-松苓新酸

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取DGD9供試品溶液，分別于制備后0、3、6、9、12、24 h按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果，各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯變化，RSD集中在0.11%～0.32%；相對(duì)峰面積RSD集中在1.66%～3.88%；去氫茯苓酸保留時(shí)間的RSD值為0.11%，峰面積的RSD為2.72%，結(jié)果表明供試品溶液至少于24 h以內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取DGD9茯苓配方顆粒粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果，各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯變化，RSD集中在0.11%～0.24%；相對(duì)峰面積RSD集中在1.22%～4.93%；去氫茯苓酸保留時(shí)間的RSD值為0.11%，峰面積RSD為1.22%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

（4）加樣回收率試驗(yàn)：精密量取已知含量的DGD9茯苓配方顆粒粉末6份，每份相當(dāng)于茯苓飲片2.5 g，精密加入去氫茯苓酸0.032 mg/mL對(duì)照品溶液1 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算回收率。去氫茯苓酸對(duì)照品的平均加樣回收率為91.93%，RSD為2.57%。經(jīng)《中國(guó)藥典》2020年版四部[11]可查，當(dāng)樣品中待測(cè)成分含量低于0.01%時(shí)，回收率限度可適當(dāng)放寬至85%～110%，因此該加樣回收率符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.4 茯苓飲片TD與茯苓DGD指紋圖譜建立

（1）茯苓飲片TD指紋圖譜的建立：取“2.2.2”項(xiàng)下茯苓飲片TD供試品溶液共15批，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，構(gòu)建HPLC指紋圖譜（圖2）。結(jié)果顯示15批茯苓飲片TD供試品中除溶劑峰以外均未檢測(cè)出特征峰。

（2）茯苓DGD指紋圖譜的建立：按照“2.2.2”項(xiàng)下15批茯苓DGD供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，構(gòu)建HPLC指紋圖譜。因產(chǎn)自B廠的編號(hào)為4～6批次的DGD供試品中未檢測(cè)出特征峰，因此構(gòu)建指紋圖譜時(shí)將該3個(gè)批次剔除，其他13個(gè)批次色譜圖構(gòu)建指紋圖譜，共有3個(gè)共有峰，結(jié)果見圖3。

2.3 茯苓飲片與配方顆粒的比較

2.3.1 已知峰含量測(cè)定及比較 采用外標(biāo)法分別計(jì)算15批飲片及15批配方顆粒醇提供試品中去氫茯苓酸的含量，以去氫茯苓酸為內(nèi)參物，計(jì)算茯苓酸B、茯苓酸A、去氫土莫酸、豬苓酸C、松苓新酸的相對(duì)校正因子（f/s），相對(duì)校正因子結(jié)果為茯苓酸B/去氫茯苓酸＝0.552，茯苓酸A/去氫茯苓酸＝0.852，去氫土莫酸/去氫茯苓酸＝2.604，豬苓酸C/去氫茯苓酸＝1.822，松苓新酸/去氫茯苓酸＝0.643，采用一測(cè)多評(píng)法[18]計(jì)算15批配方顆粒及15批飲片醇提供試品中茯苓酸B、茯苓酸A、去氫土莫酸、豬苓酸C、松苓新酸的含量，運(yùn)用檢驗(yàn)評(píng)價(jià)茯苓配方顆粒不同供試品中已知峰含量與茯苓飲片的差異，其中B廠未檢測(cè)出三萜類指標(biāo)性成分，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，茯苓飲片中已知成分含量較5個(gè)廠家配方顆粒的高，各廠家間已知成分含量間具有顯著差異（＜0.05）。

圖2 茯苓TD1供試品色譜圖

圖3 茯苓DGD供試品指紋圖譜

表2 茯苓飲片與配方顆粒醇提供試品中茯苓酸B、茯苓酸A、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸、松苓新酸含量比較()

與飲片比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05，**< 0.01decoction pieces

2.3.2 所有峰及已知峰總峰面積比較 將15批飲片醇提供試品色譜圖中所有峰及已知峰總峰面積的均值定為1（100%），采用歸一化法求得5個(gè)廠家配方顆粒醇提供試品所有峰及已知峰總峰面積的相對(duì)值。結(jié)果顯示，A、B、C、D、E廠配方顆粒醇提供試品中總成分含量的相對(duì)總和比值分別為4.71%、0.49%、4.52%、49.58%、3.41%，已知成分含量的相對(duì)總和比值分別為5.99%、0.00%、6.03%、51.69%、4.31%，說(shuō)明A、B、C、D、E廠配方顆粒醇提供試品中總成分含量及已知成分含量均低于飲片醇提供試品。

2.3.3 校正分析 以茯苓飲片醇提供試品信息為標(biāo)準(zhǔn)，以指標(biāo)成分及所有成分分別采用峰面積加和法[5]計(jì)算5個(gè)廠家配方顆粒臨床推薦當(dāng)量的校正系數(shù)（當(dāng)量即為使用劑量）。

采用峰面積加和法，以4個(gè)指標(biāo)成分（去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸、松苓新酸）進(jìn)行校正系數(shù)的計(jì)算。首先計(jì)算得各廠家4個(gè)指標(biāo)成分峰面積之和的平均值，后求得其與飲片醇提供試品中4個(gè)指標(biāo)成分峰面積之和均值的比值，即校正系數(shù)，后依次計(jì)算各廠實(shí)際當(dāng)量，結(jié)果見表3。

采用峰面積加和法，以所有成分進(jìn)行校正系數(shù)的計(jì)算。首先計(jì)算得各廠家所有峰峰面積之和的平均值，后求得其與飲片醇提供試品中所有峰峰面積均值的比值，即校正系數(shù)，各廠校正系數(shù)依次為A廠0.047，B廠0.005，C廠0.045，D廠0.496，E廠0.034，本實(shí)驗(yàn)計(jì)算當(dāng)量依次為：A廠1∶0.8，B廠1∶0.05，C廠1∶0.5，D廠1∶0.8，E廠1∶0.7，建議在臨床推薦當(dāng)量上做相應(yīng)調(diào)整。

表3 配方顆粒中4個(gè)指標(biāo)成分校正系數(shù)(峰面積加和法)

2.4 茯苓TD與茯苓DGD比較

2.4.1 已知峰含量測(cè)定及比較 采用外標(biāo)法分別計(jì)算15批配方顆粒DGD供試品中去氫茯苓酸的含量，以去氫茯苓酸為內(nèi)參物同“2.3.1”項(xiàng)下一測(cè)多評(píng)法計(jì)算15批配方顆粒DGD供試品中茯苓酸B、茯苓酸A、去氫土莫酸、豬苓酸C、松苓新酸的含量，運(yùn)用檢驗(yàn)評(píng)價(jià)茯苓配方顆粒不同供試品中已知峰含量與茯苓飲片的差異，如表4所示，TD和B廠中未檢測(cè)出三萜類指標(biāo)性成分，各廠家茯苓DGD供試品中三萜類指標(biāo)性成分含量具有較大差異：含有指標(biāo)性成分的A、C、D、E 4個(gè)配方顆粒廠家中，D廠、E廠的多數(shù)成分相對(duì)較高，A廠各成分相對(duì)均衡，而C廠部分指標(biāo)性成分缺失。說(shuō)明B廠配方顆粒制備工藝與傳統(tǒng)湯劑制備工藝相近，不同廠家配方顆粒質(zhì)量參差不齊，可能與不同廠家所用飲片質(zhì)量不一致有關(guān)，如藥材原產(chǎn)地、藥材采集時(shí)間、飲片炮制工藝以及飲片貯存方式的不同。茯苓DGD組與配方顆粒醇提組相比，說(shuō)明兩種不同的供試品制備方法對(duì)三萜類成分的轉(zhuǎn)化率影響不大。

表4 茯苓TD與DGD供試品中茯苓酸B、茯苓酸A、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸、松苓新酸含量比較()

與TD比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01TD

2.4.2 所有峰及已知峰總峰面積比較 將D廠3批DGD色譜圖中所有峰及已知峰總峰面積的均值分別定為1（100%），采用歸一化法求得TD及其他4個(gè)廠家DGD供試品中所有峰及已知峰總峰面積的相對(duì)值。結(jié)果顯示TD、A、B、C、E廠DGD中總成分含量的相對(duì)總和比值分別為3.90%、12.38%、1.97%、10.47%、8.57%，已知成分含量的相對(duì)總和比值分別為0.00%、12.08%、0.00%、9.00%、8.54%，說(shuō)明TD、A、B、C、E廠DGD中總成分及已知成分含量總和均低于D廠。

2.4.3 各廠家配方顆粒質(zhì)量比較 主成分分析（principal component analysis，PCA）可對(duì)復(fù)雜信息中的多變量進(jìn)行快速提取、降維分析，通過(guò)降維可排除眾多化學(xué)信息中相互重疊的信息，生成新的綜合變量即主成分，經(jīng)投影處理后，樣本最終落在主成分組成平面上的位置，即可表征不同樣本的總體信息[19-21]。本研究以15批茯苓配方顆粒DGD供試品中茯苓酸B、茯苓酸A、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸及松苓新酸的含量為變量，采用多元變量統(tǒng)計(jì)軟件SIMCA 14.1進(jìn)行PCA。以15批茯苓配方顆粒DGD供試品中茯苓酸B、茯苓酸A、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸及松苓新酸的含量為坐標(biāo)軸構(gòu)建主成分平面，將樣本的多元變量通過(guò)降維的方式投影在二維平面上，以觀察樣本的整體分布情況和各變量對(duì)樣本分布的貢獻(xiàn)大小，結(jié)果見圖4。由圖4可看出，不同廠家樣品出現(xiàn)明顯的分類，D、E廠的3個(gè)批次間分布最分散，表明2廠不同批次配方顆粒原料藥材質(zhì)量不一致或生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定，A廠相對(duì)集中，表明2個(gè)廠家的配方顆粒質(zhì)量相對(duì)比較穩(wěn)定，而C廠最為集中，說(shuō)明該廠配方顆粒質(zhì)量最穩(wěn)定。

圖4 配方顆粒PCA分析散點(diǎn)圖

3 討論

3.1 傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑對(duì)比時(shí)原料來(lái)源一致性探討

實(shí)驗(yàn)所用載體為臨床處方用量較大、頻率較高的茯苓，旨在研究單味中藥茯苓傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑二者之間的差異規(guī)律，包括二者成分上的異同或含量多少的差異。理論上，實(shí)驗(yàn)所用飲片應(yīng)與市售配方顆粒原材料保持一致；但本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)初衷是基于對(duì)“真實(shí)世界”臨床用藥的考量，故選擇不做過(guò)多主觀人為干預(yù)，不刻意保持批號(hào)的對(duì)應(yīng)和統(tǒng)一。原因在于：一方面，不同廠家所用飲片與在醫(yī)院、藥店所購(gòu)得飲片其質(zhì)量檔次上相差很大；另一方面，若選用自購(gòu)飲片制備自制顆粒，則存在實(shí)驗(yàn)室的制備過(guò)程與成型化的工業(yè)大生產(chǎn)間存在較大差距，得出的結(jié)論并不足以指導(dǎo)臨床。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇不同批次飲片和配方顆粒，目的是為了所得出的結(jié)論更能反應(yīng)臨床實(shí)際。

3.2 茯苓TD與茯苓DGD的制備工藝比較

因三萜類成分本不溶于水[22]，15批TD供試品中未檢測(cè)到三萜類指標(biāo)性成分，而12批DGD供試品中有3個(gè)三萜類指標(biāo)性成分，DGD、配方顆粒醇提供試品中均檢測(cè)出含有三萜類成分，表明除B廠以外的4個(gè)配方顆粒生產(chǎn)企業(yè)采用了不同于傳統(tǒng)湯劑的提取工藝，以保證配方顆粒的質(zhì)量，經(jīng)現(xiàn)有茯苓配方顆粒專利查詢[23-27]可以預(yù)測(cè)這4個(gè)廠家在制備配方顆粒過(guò)程中，D廠各指標(biāo)成分含量均較高，可能采用了區(qū)別于傳統(tǒng)湯劑制備所用的溶媒提取茯苓飲片得到了浸膏，并將浸膏與飲片原粉混合后制備得到配方顆粒；A廠及E廠指標(biāo)成分含量相對(duì)均衡，可能是這兩廠在制備過(guò)程中采用飲片超微粉代替輔料與水提所得浸膏混合制粒；而C廠某些指標(biāo)成分缺失，考慮其制備工藝與其他廠家存在差異，而B廠可能是在“遵古”的指導(dǎo)思想下，以水提物制粒，因此未檢測(cè)出三萜類指標(biāo)性成分。PCA結(jié)果顯示C廠最為集中，A廠相對(duì)集中，D、E廠3個(gè)批次間分布最分散，表明同一廠家不同批次間配方顆粒質(zhì)量不一，這可能與原藥材飲片質(zhì)量不一致，配方顆粒生產(chǎn)廠家制備工藝不穩(wěn)定有關(guān)。以上分析表明現(xiàn)代配方顆粒在制備工藝上并未完全遵古，不同配方顆粒生產(chǎn)廠家的制備工藝存在差異，這些對(duì)于保證臨床一致性是不利的，因此有關(guān)配方顆粒的制備工藝仍待進(jìn)一步探討。

3.3 茯苓飲片及其配方顆粒用法芻議

《圣濟(jì)總錄》中茯苓散以溫酒調(diào)服治療男子小便余瀝不盡，《普濟(jì)方》中以桑螵蛸、龍骨、茯苓為末制得的鎖陽(yáng)丹經(jīng)米飲調(diào)服治療膀胱疾；《傷寒論》及《金匱要略》中含茯苓的方劑經(jīng)統(tǒng)計(jì)歸納，共36首[28]，入湯劑22首，散劑7首，丸劑7首，其中散劑、丸劑多米飲、酒送服，取茯苓利水之功，湯劑水煎后去滓服用則多奏健脾、安神之效，表明茯苓的傳統(tǒng)用法與功效間存在一定的規(guī)律性，制法和用法不同，療效也不盡相同。另外，當(dāng)茯苓與桂枝、干姜、澤瀉配伍時(shí)，多主利水，如五苓散；與白術(shù)、半夏配伍主健脾，如理中丸；與人參配伍主健脾安神，如茯苓四逆湯，表明在不同的用藥配伍中茯苓所主功效也有不同。

細(xì)野史郎等[29]匯總了近些年茯苓利尿作用的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)家兔口服茯苓水性顆粒劑后無(wú)利尿作用，健康志愿者服用茯苓后利尿效果也不盡如人意，表明茯苓單煎的利水作用不強(qiáng)?，F(xiàn)代臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，茯苓貼敷神闕穴可顯著降低內(nèi)痔術(shù)后尿潴留發(fā)生率[30]。現(xiàn)代有實(shí)驗(yàn)人員將茯苓打粉后加水回流提取、濾布過(guò)濾、濃縮得浸膏后，所得茯苓水提物粉末經(jīng)甲醇超聲得供試品溶液，后采用UPLC法檢測(cè)到三萜類成分并建立了指紋圖譜[31]，但該供試品制備是將茯苓飲片打粉后制備，該操作可能會(huì)使茯苓粉末隨濾液通過(guò)濾布一同濾出，而本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖沁M(jìn)行茯苓配方顆粒湯劑與茯苓傳統(tǒng)湯劑的對(duì)比研究，在最大程度上與傳統(tǒng)湯劑的制備保持一致，因此茯苓傳統(tǒng)湯劑以茯苓飲片直接加水進(jìn)行煎煮，實(shí)驗(yàn)結(jié)果茯苓傳統(tǒng)湯劑中未檢測(cè)到三萜類成分，而飲片醇提供試品中檢測(cè)到該類成分，實(shí)驗(yàn)人員隨后對(duì)傳統(tǒng)湯劑煎煮后的藥渣進(jìn)行處理，最終在藥渣醇提供試品中檢測(cè)到了三萜類成分，再次佐證了水提不能使茯苓中的三萜類成分溶出。結(jié)合傳統(tǒng)用法可推測(cè)：一方面，現(xiàn)代臨床使用茯苓飲片及配方顆粒時(shí)應(yīng)依據(jù)病證，選擇合理劑型或能達(dá)到最佳用藥目的，例如將茯苓制散劑以水、米飲、溫酒送服或能使其利尿功效達(dá)到最佳；另一方面，茯苓單煎其三萜類成分不易溶出，但與其他藥物合煎，可能會(huì)使其溶出，此方面內(nèi)容有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。

3.4 指標(biāo)性成分種類的選擇探討

茯苓為利水滲濕藥，三萜類及多糖是其主要活性物質(zhì)，其中茯苓三萜類具有較強(qiáng)的利水作用，針對(duì)其利水這一主要功效，研究其與利水功效相關(guān)的代表成分，更具針對(duì)性和研究意義，因此本實(shí)驗(yàn)以三萜類化學(xué)成分為指標(biāo)性成分進(jìn)行茯苓配方顆粒湯劑和傳統(tǒng)湯劑間的比較。但茯苓所含多糖也是其主要活性物質(zhì)[14-15]之一，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保肝等藥理活性[32]，目前對(duì)于茯苓多糖的含量測(cè)定方法已十分成熟[33-35]，但對(duì)于茯苓傳統(tǒng)湯劑及配方顆粒湯劑的多糖測(cè)定涉及較少，如何消除配方顆粒中多糖類輔料對(duì)茯苓多糖測(cè)定的影響是開展茯苓傳統(tǒng)湯劑及配方顆粒湯劑多糖類化學(xué)成分對(duì)比研究需要重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題，本課題組后期將對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行深入的研究，旨在進(jìn)一步為茯苓配方顆粒乃至茯苓飲片的合理應(yīng)用提供更為系統(tǒng)和科學(xué)的依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparative study on chemical constituents oftraditional decoction and formula granule decoction

YUE You-song1, ZHANG Lu2, XIE Meng-di1, WANG Ke-han2, ZHANG Pu1, ZHANG Hui-jie1, WANG Yan-li2, GUI Xin-jing2, 3, 4, SHI Jun-han2, 3, 4, YAO Jing2, 3, 4, LIU Rui-xin2, 3, 4, LI Xue-lin2, 3, 4

1. Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China 2. Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China 3. Henan Engineering Research Center for Modernization of Clinical Application of Chinese Herbal Pieces, Zhengzhou 450000, China 4. Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Respiratory Diseases with Traditional Chinese Medicine, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China

Takingas the research object and to performs a comparative study on the chemical constituents in its traditional decoction and dispensing granule, so as to provide references for rational clinical application ofdispensing granule.Fifteen batches ofdecoction pieces from different producing areas or batches and three batches of dispensing granule from five manufacturers were selected. Then the HPLC fingerprints of decoction pieces and dispensing granule were established, which was used to be evaluated from three aspects: the kinds of chemical components of triterpenoid, the content of index components of triterpenoid and the sum of all peak areas. Moreover, the data was statistically analyzed by principal component analysis.The kinds of chemical components of triterpenoid: index components of triterpenoid were not detected in traditional decoction ofdecoction pieces while more than three kinds of index components of triterpenoids were found in the decoction of dispensing granule provided by most manufacturers. The above components were not detected in only one manufacturer which has the same situation like the traditional decoction ofdecoction pieces. The content of index components of triterpenoid: in terms of the content of index components of triterpenoid, there are great differences indispensing granule from the four manufacturers, namely, manufacture A, C, D, and E. Among them, manufacturer D and E have higher content in most components; Manufacturer A had relatively balanced content of each ingredient; While some index components were absent in manufacturer C. Sum of all peak areas: The sum of all peak areas of dispensing granule decoction in manufacturer D was set as 100%, compared with it, all the peak areas in traditional decoction were 3.90%, manufacturer A 12.38%, manufacturer B 1.97%, manufacturer C 10.47%, and manufacturer E 8.57%. The results of principal component analysis showed that the quality of different batches in the same manufacturer was different. The extent of quality in the three batches of plant C was mostly concentrated, plant A was relatively concentrated, and plant D and E were the most dispersed.There are obvious differences in the types of triterpenoids between the traditional decoction and dispensing granule decoction ofdecoction pieces. The kinds, content and batches stability of triterpenoids are also different among every manufacturer’sdispensing granule decoction, which suggests that the preparation process of dispensing granule is not identical in each manufacturer and the researchers should further discuss the preparation process and rational application ofdispensing granule andpieces.

(Schw.) Wolf; traditional decoction; dispensing granule; HPLC; triterpenes; principal components analysis

R283.6

A

0253 - 2670(2021)13 - 3852 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.009

2021-03-08

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81773892）；河南省首批自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（162300410187）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（16A360021）；河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題（2016ZY2055）；河南省中醫(yī)管理局國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地科研專項(xiàng)（2018JDZX039）；河南省中醫(yī)藥拔尖人才培養(yǎng)項(xiàng)目資助（2019ZYBJ07）；河南省衛(wèi)生健康中青年學(xué)科帶頭人專項(xiàng)（HNSWJW- 2020014）

岳佑?。?996—），女，碩士研究生，主要從事中藥飲片臨床應(yīng)用現(xiàn)代化關(guān)鍵技術(shù)研究。Tel: (0371)66245142 E-mail: xuelinli450000@163.com

李學(xué)林（1960—），男，教授，博士生導(dǎo)師，主任藥師，主要從事中藥應(yīng)用形式研究。Tel: (0371)66245142 E-mail: xuelinli450000@163.com

劉瑞新（1980—），男，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主任藥師，從事中藥飲片臨床應(yīng)用現(xiàn)代化關(guān)鍵技術(shù)研究。Tel: (0371)66233562 E-mail: liuruixin7@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]