袁瑞芳，楊金輝，章津銘，賀亞男，任 涵，張定堃*，楊 明

基于偏頭痛藥效優(yōu)化青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑的成型工藝及其安全性評(píng)價(jià)

袁瑞芳1，楊金輝2，章津銘1，賀亞男1，任 涵1，張定堃1*，楊 明3*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137 2. 四川百草精工生物科技有限公司，四川 成都 610000 3. 江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004

基于偏頭痛藥效研究?jī)?yōu)化青花椒超臨界提取部位熱熔壓敏膠貼劑成形工藝，并對(duì)貼劑安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。以均勻性、涂展性、滲布程度、皮膚追隨性、剝離性、反復(fù)揭貼性、殘留量等感官評(píng)價(jià)及初黏力、持黏力、剝離強(qiáng)度為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)與Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對(duì)熱熔壓敏膠基質(zhì)配比進(jìn)行篩選；采用在體動(dòng)物評(píng)價(jià)法，以硝酸甘油型偏頭痛大鼠撓頭次數(shù)為指標(biāo)篩選貼劑載藥量；另外采用小鼠急性毒性試驗(yàn)、家兔皮膚刺激性試驗(yàn)及豚鼠皮膚過(guò)敏性試驗(yàn)評(píng)價(jià)青花椒超臨界提取部位熱熔壓敏膠貼劑的安全性。熱熔壓敏膠貼劑的最佳基質(zhì)處方為苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯（SIS）彈性體-氫化石油樹(shù)脂-液體石蠟4∶2∶5；青花椒超臨界提取部位貼劑可明顯減少硝酸甘油型偏頭痛大鼠的撓頭次數(shù)，70 mg/貼載藥量組在30～60 min可將大鼠撓頭次數(shù)降低81.75%，優(yōu)選為最佳載藥量；該貼劑對(duì)小鼠無(wú)急性毒性，對(duì)新西蘭兔完整皮膚和破損皮膚有輕微刺激性，6 h內(nèi)自行消除，對(duì)豚鼠無(wú)過(guò)敏性。該工藝制備的青花椒超臨界提取部位熱熔壓敏膠貼劑感官性能好，黏附力強(qiáng)，且安全有效。

青花椒；超臨界提取部位；熱熔壓敏膠；貼劑；偏頭痛；成型工藝；安全性評(píng)價(jià)；Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；急性毒性；皮膚刺激性；皮膚過(guò)敏性

青花椒為蕓香科花椒屬植物青花椒Sieb. et Zucc.的干燥成熟果皮[1]，與紅花椒統(tǒng)稱花椒，具有溫中散寒止痛、殺蟲(chóng)止癢的功效，在西南地區(qū)廣泛分布。《藥性論》記載：花椒“治頭風(fēng)下淚”，中醫(yī)學(xué)的“頭風(fēng)”包含了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的偏頭痛[2]，民間亦有使用花椒治療偏頭痛的用法[3]。在傳統(tǒng)本草中，花椒主要用于止痛，現(xiàn)代多項(xiàng)藥理研究也證實(shí)了其鎮(zhèn)痛作用[4-5]，但對(duì)花椒的抗偏頭痛作用研究甚少。研究表明青花椒的鎮(zhèn)痛效應(yīng)與持續(xù)時(shí)間均大于紅花椒，毒性低于紅花椒[6-7]，基于此，本課題組前期對(duì)青花椒治療偏頭痛的療效進(jìn)行研究，證實(shí)外用青花椒超臨界提取部位可明顯緩解大鼠偏頭痛癥狀。

透皮給藥是中醫(yī)內(nèi)病外治的經(jīng)典用法之一[8]，具有避開(kāi)肝臟首過(guò)效應(yīng)、減少胃腸道刺激、降低給藥次數(shù)及提高患者用藥順應(yīng)性等優(yōu)勢(shì)[9-10]，國(guó)內(nèi)外已有多種透皮貼劑的上市產(chǎn)品，臨床應(yīng)用普遍[11]。熱熔壓敏膠是繼溶劑型和乳液型壓敏膠之后的第3代壓敏膠產(chǎn)品，一般由彈性體、增黏樹(shù)脂、增塑劑、填料和抗氧化劑組成[12]，因其無(wú)有機(jī)溶劑添加[13]，無(wú)刺激性[14]，在熔融狀態(tài)下涂布，迅速冷卻固化后輕度指壓即能粘接，黏附及剝離性好，不污染被粘物表面[15]，故在透皮給藥體系中應(yīng)用廣泛[12,16]。熱熔壓敏膠基質(zhì)不含活性官能團(tuán)，可減少基質(zhì)和藥物之間的相互作用，現(xiàn)作為一種釋藥性能良好的骨架型藥物儲(chǔ)庫(kù)被使用[17]。此外，該基質(zhì)的各種成分均為非極性，親脂性強(qiáng)，制備過(guò)程中不需要烘箱固化交聯(lián)，故尤其適合用于制備含有易揮發(fā)性藥物的貼劑[18-19]，與本實(shí)驗(yàn)青花椒藥用部位性能契合?；谝陨涎芯?，本課題組擬將青花椒超臨界提取部位開(kāi)發(fā)為一款緩解偏頭痛的熱熔壓敏膠透皮給藥貼劑，使其成為易給藥、易揭貼、起效迅速、安全無(wú)毒的局部給藥產(chǎn)品，促進(jìn)防治偏頭痛產(chǎn)品的創(chuàng)新[20]，為青花椒藥用價(jià)值發(fā)掘提供示范，推動(dòng)西南特色中藥資源開(kāi)發(fā)利用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SFE230-50-06 CO2超臨界提取裝置，海安華達(dá)石油儀器有限公司；XKR-XB320D實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)涂布機(jī)，常州德社精密儀器有限公司；BLD-200N電子剝離試驗(yàn)機(jī)、CZY-G初黏力測(cè)試儀、CZY-6S持黏力測(cè)試儀，濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司。

1.2 供試藥與輔料

干青花椒果皮于2019年購(gòu)自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)許潤(rùn)春副教授鑒定為蕓香科花椒屬植物青花椒Sieb. et Zucc.的干燥飲片。對(duì)照品檸檬烯（批號(hào)DSTDN003701）、芳樟醇（批號(hào)DST200618-041質(zhì)量分?jǐn)?shù)），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥97%，均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯（SIS）彈性體，批號(hào)D1163，購(gòu)于美國(guó)科騰聚合物有限公司；C5氫化石油樹(shù)脂，購(gòu)于深圳市吉田化工有限公司；液體石蠟，購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量220～250 g；SPF級(jí)昆明小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g；新西蘭家兔8只，體質(zhì)量2.0～2.2 kg；白色豚鼠30只，體質(zhì)量260～280 g；所有動(dòng)物雌雄各半，均由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)SCXK（川）2020- 030，檢疫后備用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2019KY-082）。

2 方法與結(jié)果

2.1 青花椒超臨界提取物的制備

稱取青花椒2 kg，打粉后過(guò)10目篩，裝入超臨界CO2萃取裝置中，萃取壓力26 MPa，溫度60 ℃，解析壓力7 MPa，溫度55 ℃，CO2體積流量3 L/h，萃取6 h后得藥用部位。萃取得到的青花椒超臨界提取部位呈墨綠色，有較濃清香味，流動(dòng)性好，萃取率為12.3%。

2.2 青花椒超臨界提取物的GC-MS分析

2.2.1 供試品溶液的制備 取上述提取的青花椒超臨界提取物1 mL置于10 mL量瓶中，超聲10min，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)制得樣品，平行3份。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密吸取檸檬烯對(duì)照品10 μL于10 mL量瓶中，經(jīng)稱量為9.68 mg，加入醋酸乙酯定容，配制成質(zhì)量濃度為0.968 mg/mL的檸檬烯對(duì)照品溶液；精密吸取芳樟醇對(duì)照品10 μL于10 mL量瓶中，經(jīng)稱量為9.45 mg，加入醋酸乙酯定容，配制成質(zhì)量濃度為0.945 mg/mL的芳樟醇對(duì)照品溶液。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為HP-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；采用程序升溫方法：60 ℃維持2 min，5 ℃/min升至200 ℃，停留5 min，最后10 ℃/min升至260 ℃，停留0 min，運(yùn)行時(shí)間41 min；載氣為高純氦氣，體積流量1 mL/min，壓力86.440 kPa（12.537 psi），氣化室溫度為280 ℃，分流比100∶1，進(jìn)樣量1 μL。

2.2.4 質(zhì)譜條件 電離方式為EI源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃。結(jié)果如圖1所示，經(jīng)GC-MS分析，青花椒超臨界提取物中共鑒定出31種成分，其中豐度最高的為芳樟醇，占比達(dá)到74.16%，質(zhì)量濃度為13.57 mg/mL，其次為檸檬烯，占比5.45%，質(zhì)量濃度為1.75 mg/mL。

圖1 芳樟醇(a)、檸檬烯(b) 對(duì)照品及青花椒超臨界提取物(c)的總離子流圖

2.3 空白基質(zhì)的制備

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，熱熔壓敏膠空白基質(zhì)的初始制備方法為SIS彈性體6 g、C5石油樹(shù)脂3 g及液體石蠟6 g加入坩堝中，電熱套升溫至120 ℃，至混合物完全熔化、攪拌均勻，倒出涂布于無(wú)紡布上，冷卻后加蓋防粘紙，剪成3 cm×4 cm，備用。

2.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)與檢測(cè)方法

2.4.1 感官評(píng)價(jià) 以均勻性、涂展性、滲布程度、皮膚追隨性、剝離性、反復(fù)揭貼性與殘留量的多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)總分為指標(biāo)[8,21]，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

2.4.2 初黏力 采用《中國(guó)藥典》2020年版四部通則（0952黏附力測(cè)定法）中載入的滾球斜坡停止法測(cè)定熱熔壓敏膠貼劑的初黏力。選用適宜的系列鋼球分別滾過(guò)置于傾斜板上的供試品黏性面，根據(jù)供試品黏性面能夠粘住的最大球號(hào)鋼球，評(píng)價(jià)其初黏力的大小，球號(hào)越大，初黏力越大。根據(jù)被粘住的球號(hào)進(jìn)行評(píng)分，分值范圍為0～10分。

2.4.3 持黏力 采用《中國(guó)藥典》2020年版四部通則（0952黏附力測(cè)定法）中載入的持黏力測(cè)定法測(cè)定熱熔壓敏膠貼劑的持黏力。將供試品黏性面粘貼于試驗(yàn)板表面，垂直放置，沿供試品的長(zhǎng)度方向懸掛一規(guī)定質(zhì)量的砝碼，記錄供試品滑移直至脫落的時(shí)間，時(shí)間越長(zhǎng)，持黏力越大。根據(jù)供試品脫落的時(shí)間進(jìn)行評(píng)分，分值范圍為0～10分。

2.4.4 剝離強(qiáng)度 采用《中國(guó)藥典》2020年版四部通則（0952黏附力測(cè)定法）中載入的180°剝離強(qiáng)度試驗(yàn)法測(cè)定熱熔壓敏膠貼劑的剝離強(qiáng)度。將供試品背襯用雙面膠固定在試驗(yàn)板上，黏性面用聚脂薄膜覆蓋，將聚酯薄膜對(duì)折（180°），把薄膜自由端和試驗(yàn)板分別上、下夾持于試驗(yàn)機(jī)上，實(shí)驗(yàn)機(jī)以300 mm/min下降速度連續(xù)剝離，記錄剝離強(qiáng)度的數(shù)值，該值越大表明剝離強(qiáng)度越強(qiáng)。根據(jù)剝離強(qiáng)度的數(shù)值進(jìn)行評(píng)分，分值范圍為0～10分。

2.4.5 綜合得分 以均勻性、涂展性、滲布程度、皮膚追隨性、剝離性、反復(fù)揭貼性、殘留量、初黏力、持黏力和剝離強(qiáng)度評(píng)分之和作為貼劑的綜合得分。

2.5 單因素篩選基質(zhì)處方

2.5.1 SIS彈性體用量篩選 固定C5氫化石油樹(shù)脂用量為3 g，液體石蠟用量為6 g，將SIS彈性體的用量設(shè)為2、4、6、8、10 g，按“2.3”項(xiàng)下空白基質(zhì)的制備方法進(jìn)行制備。通過(guò)感官綜合評(píng)價(jià)，不同劑量SIS彈性體制備的熱熔壓敏膠貼劑的平均綜合得分分別為25.0、44.6、52.6、50.3、47.3。可見(jiàn)，SIS彈性體用量為6 g時(shí)，熱熔壓敏膠貼劑的綜合感官較好。

表1 綜合感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.5.2 C5氫化石油樹(shù)脂用量篩選 固定SIS彈性體用量為6 g，液體石蠟用量為6 g，將氫化石油樹(shù)脂的用量設(shè)為1、2、3、4、5 g，按“2.3”項(xiàng)下空白基質(zhì)的制備方法進(jìn)行制備。通過(guò)感官綜合評(píng)價(jià)，不同劑量C5氫化石油樹(shù)脂制備的熱熔壓敏膠貼劑的平均綜合得分分別為46.3、52.6、52.7、49.9、48.3?？梢?jiàn)，C5氫化石油樹(shù)脂用量為2～3 g時(shí)，熱熔壓敏膠貼劑的綜合感官較好。

2.5.3 液體石蠟用量篩選 固定SIS彈性體用量為6 g，C5氫化石油樹(shù)脂用量為3 g，將液體石蠟的用量設(shè)為2、4、6、8、10 g，按“2.3”項(xiàng)下空白基質(zhì)的制備方法進(jìn)行制備。通過(guò)感官綜合評(píng)價(jià)，不同液體石蠟制備的熱熔壓敏膠貼劑的平均綜合得分分別為44.0、46.6、50.6、52.3、44.6。可見(jiàn)，液體石蠟用量為8 g時(shí)，熱熔壓敏膠貼劑的綜合感官較好。

2.6 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化基質(zhì)處方

2.6.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理和單因素試驗(yàn)結(jié)果，以SIS彈性體用量（1）、氫化石油樹(shù)脂用量（2）、液體石蠟用量（3）為自變量，感官評(píng)價(jià)、初黏力、持黏力和剝離強(qiáng)度的分值總和為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。因素水平及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

2.6.2 建立模型方程與顯著性檢驗(yàn) 利用軟件Design-Expert 12.0分析對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到基質(zhì)綜合評(píng)分與各因素變量的二次方程模型為＝47.464＋7.2321＋17.0022－4.1733－0.52212＋1.11813＋0.3323－1.05112－2.322－0.25532。

回歸模型方差分析結(jié)果如表3所示，不同SIS彈性體、氫化石油樹(shù)脂及液體石蠟用量對(duì)綜合評(píng)分交互影響的等高線及響應(yīng)面圖如圖2所示，＝0.001 7，＝21.83，表明此模型達(dá)到顯著水平，失擬項(xiàng)（＝0.6344）不顯著，說(shuō)明該二次方程能夠較好地?cái)M合真實(shí)水平，實(shí)驗(yàn)誤差小，可用此模型對(duì)熱熔壓敏膠貼劑基質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。模型一次項(xiàng)1、2高度顯著，3不顯著；交互項(xiàng)13高度顯著，12、23不顯著；二次項(xiàng)12高度顯著，22顯著，32不顯著。根據(jù)值可知各基質(zhì)用量對(duì)貼劑基質(zhì)綜合評(píng)分的影響程度依次為1＞2＞3，即SIS彈性體用量＞氫化石油樹(shù)脂用量＞液體石蠟用量。

表2 Box-Benhnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及結(jié)果(n = 3)

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

2.6.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 設(shè)定各成分的變化范圍以及期望響應(yīng)值，運(yùn)行Design-Expert 12.0軟件的最優(yōu)化功能，以各指標(biāo)綜合結(jié)果評(píng)分曲面得出的最佳處方組成為SIS彈性體7.885 g，氫化石油樹(shù)脂3.520 g，液體石蠟10.000 g，貼劑基質(zhì)綜合得分的理論值可達(dá)88.543。按照最優(yōu)組合進(jìn)行了3批驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果3批貼劑的實(shí)際綜合評(píng)分分別為87.432、85.673、85.491，平均實(shí)際綜合評(píng)分為86.199，RSD為1.244%，與理論值的接近度為97.35%，因此基于響應(yīng)面法優(yōu)化的基質(zhì)配比準(zhǔn)確可靠，熱熔壓敏膠貼劑的最佳基質(zhì)處方為SIS彈性體-氫化石油樹(shù)脂-液體石蠟4∶2∶5。

2.7 載藥量篩選

2.7.1 青花椒超臨界提取部位熱熔壓敏膠貼劑的制備 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，取SIS彈性體8 g、氫化石油樹(shù)脂4 g、液體石蠟10 g加入坩堝中，電熱套升溫至120 ℃，至混合物完全熔化、攪拌均勻，加入設(shè)計(jì)量青花椒揮發(fā)油攪拌均勻，倒出涂布于無(wú)紡布上，冷卻后加蓋防黏紙，剪成3 cm×4 cm，分別制備成每貼含青花椒揮發(fā)油17.5、35、70、140 mg的貼劑。試驗(yàn)過(guò)程中，熱熔壓敏膠基質(zhì)與青花椒超臨界提取物均勻混合，相容性良好，所制備的青花椒超臨界提取部位熱熔壓敏膠貼劑呈淡綠色，有淡清香味，貼敷后的綜合感官及黏附性能與空白基質(zhì)基本一致。

圖2 不同SIS彈性體、氫化石油樹(shù)脂及液體石蠟用量對(duì)綜合評(píng)分交互影響的等高線及響應(yīng)面圖

2.7.2 硝酸甘油型偏頭痛大鼠試驗(yàn)[22]SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為6組（＝10），分別為對(duì)照組（空白貼劑）、模型組、給藥1組（140 mg/貼）、給藥2組（70 mg/貼）、給藥3組（35 mg/貼）、給藥4組（17.5 mg/貼)。實(shí)驗(yàn)前1 d大鼠背部脫毛。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天除對(duì)照組外，各組大鼠后頸背部sc硝酸甘油10 mg/kg復(fù)制偏頭痛模型，造模30 min后除模型組外，各實(shí)驗(yàn)組大鼠在背部脫毛處貼敷青花椒揮發(fā)油貼劑1次（給藥面積為3 cm×4 cm），從造模開(kāi)始記錄3 h內(nèi)不同時(shí)間段大鼠的搔頭次數(shù)。結(jié)果如表4所示。與對(duì)照組相比，模型組與給藥組大鼠在給予硝酸甘油后撓頭次數(shù)明顯增加（＜0.01），表明急性偏頭痛模型制備成功。與模型組相比，青花椒超臨界提取部位貼劑可明顯減少大鼠撓頭次數(shù)（＜0.01、0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了青花椒超臨界提取部位的抗偏頭痛作用。

各給藥組之間比較發(fā)現(xiàn)，30～60 min隨著載藥量的增加，大鼠撓頭次數(shù)逐漸減少（＜0.01），但當(dāng)載藥量增加至一定限度時(shí)，大鼠撓頭次數(shù)卻逐漸增加。給藥1組載藥量最大，給藥2組次之，但給藥2組可在30～60 min內(nèi)最大限度地將大鼠撓頭次數(shù)降低81.75%，即抗偏頭痛作用最顯著。60 min起，給藥3、4組大鼠撓頭次數(shù)的降低趨勢(shì)較于2組更加明顯但4組差異較小?？紤]到偏頭痛患者對(duì)于治療藥物速效的需求，選擇給藥2組作為貼劑最佳載藥量。

表4 不同給藥劑量貼劑對(duì)硝酸甘油型偏頭痛大鼠撓頭次數(shù)的影響(, n = 10)

與對(duì)照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group

2.8 青花椒超臨界提取部位熱熔壓敏膠貼劑安全性評(píng)價(jià)

2.8.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)[23]采用最大給藥量法，取小鼠數(shù)只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后背部剃毛4 cm×5 cm，24 h后檢查去毛皮膚是否完整無(wú)受傷，挑選皮膚完整無(wú)受傷的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

取禁食（不禁水）12 h的小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白雌性對(duì)照組（＝10）、空白雄性對(duì)照組（＝10）、給藥雌性組（＝10）和給藥雄性組 （＝10）。給藥組給予青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑（140 mg/貼），空白對(duì)照組給予等體積的空白基質(zhì)。將供試品1 d 2次貼于脫毛區(qū)，用膠帶固定，用藥24 h后，除去受試物，于30～60 min及24、48、72 h連續(xù)觀察至14 d。逐一記錄每只動(dòng)物體質(zhì)量變化和反應(yīng)情況，如有毒性反應(yīng)，逐一記錄發(fā)抖、震顫、流涎、腹瀉、懶動(dòng)、嗜睡、昏迷等表現(xiàn)，如有死亡或?yàn)l臨死亡的動(dòng)物進(jìn)行尸解和病理組織學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。揭除貼劑后30～60 min及24、48、72 h至14 d。與空白組比較，給藥組小鼠皮毛、眼睛、黏膜、呼吸、糞便及自主活動(dòng)等均未發(fā)現(xiàn)明顯變化，未見(jiàn)發(fā)抖、震顫、流涎、腹瀉、懶動(dòng)、嗜睡、昏迷等中毒表現(xiàn)及死亡情況。各組間小鼠凈增體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明該劑量的青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑無(wú)急性皮膚毒性反應(yīng)。

表5 青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(, n = 10)

2.8.2 家兔皮膚刺激試驗(yàn)[24]取成年健康家兔8只，雌雄各半，體質(zhì)量2.2～2.3 kg。試驗(yàn)通過(guò)完整皮膚左右側(cè)同體自身對(duì)比進(jìn)行。于給藥前24 h將家兔背部脊柱兩側(cè)毛脫掉，脫毛面積每側(cè)約為6 cm×8 cm。隨機(jī)分為2組，完整皮膚組和破損皮膚組。完整皮膚組左側(cè)去毛區(qū)敷給藥制劑3 cm×4 cm大小，右側(cè)去毛區(qū)敷賦形劑（即不含藥的空白貼片）作為對(duì)照。破損皮膚組在左側(cè)剃毛皮膚處用砂紙來(lái)回擦拭，以皮膚輕微滲血為度，實(shí)驗(yàn)方法同完整皮膚組。連續(xù)給藥1周，并于去除受試藥物后1、24、48、72 h內(nèi)觀察去毛區(qū)貼藥部位有無(wú)紅斑和水腫等癥狀，以及上述變化的恢復(fù)情況與時(shí)間，按紅斑和水腫2項(xiàng)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)按表6進(jìn)行評(píng)分。計(jì)算各組動(dòng)物刺激反應(yīng)平均分值，反應(yīng)平均分值為紅斑形成總分和水腫形成總分和與動(dòng)物數(shù)的平均值，分值在0～0.49為無(wú)刺激性，0.50～2.99為輕度刺激性，3.00～5.99為中度刺激性，6.00～8.00為強(qiáng)刺激性。結(jié)果如表7和圖3所示。空白基質(zhì)組在家兔完整皮膚和破損皮膚用藥1周后，在去除藥物1 h內(nèi)無(wú)紅斑和水腫現(xiàn)象，青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑組家兔皮膚出現(xiàn)了輕度紅斑和水腫，但在24 h內(nèi)自行消除。皮膚刺激程度平均反應(yīng)值為1.5、2.0，在0.50～2.99，屬于輕度刺激性。

表6 皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.8.3 豚鼠皮膚過(guò)敏性試驗(yàn)[25]取健康白色豚鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量260～280 g，分為基質(zhì)組、給藥組、陽(yáng)性藥對(duì)照組，每組10只。給藥組給予青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑；基質(zhì)組給予基質(zhì)貼劑；陽(yáng)性對(duì)照組給予0.2 mL 1% 2,4-二硝基氯代苯。于給藥前24 h用脫毛劑將豚鼠背部脊柱兩側(cè)毛除去，單側(cè)去毛面積為4 cm×5 cm。

（1）致敏接觸：給藥組給予青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑、基質(zhì)組給予空白基質(zhì)、陽(yáng)性對(duì)照組給予0.2 mL 1% 2,4-二硝基氯代苯在左側(cè)脫毛區(qū)，用紗布覆蓋并以膠布固定，持續(xù)6 h后用溫水清洗殘留藥物，分籠飼養(yǎng)，第7天和第14天以同樣的方式重復(fù)，共3次。

表7 青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A-完整皮膚（青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑）組 B-完整皮膚（空白基質(zhì)）組 C-破損皮膚（青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑）組 D-破損皮膚空白基質(zhì)組

（2）激發(fā)接觸：于末次給藥致敏后第14天，分別將受試物、空白基質(zhì)和陽(yáng)性藥物（激發(fā)濃度為 0.1% 2,4-二硝基氯代苯）0.2 mL同（1）方法用于3組豚鼠相應(yīng)的右側(cè)受試皮膚，給藥6 h后清除藥物并即刻觀察，然后于清除藥物后24、48、72 h再次觀察皮膚過(guò)敏反應(yīng)情況。結(jié)果按表8進(jìn)行評(píng)分并作致敏強(qiáng)度評(píng)價(jià)。同時(shí)，注意觀察豚鼠是否有哮喘，站立不穩(wěn)等全身性過(guò)敏反應(yīng)。反應(yīng)平均分值＝(紅斑形成總分＋水腫形成總分)/動(dòng)物數(shù)，致敏反應(yīng)發(fā)生率＝有過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物數(shù)/動(dòng)物總數(shù)，致敏率在0～10%為無(wú)致敏性，11%～30%為輕度致敏性，31%～60%為中毒致敏性，61%～80%為高度致敏性，81%～100%為極度致敏性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表9所示?？瞻谆|(zhì)組未見(jiàn)紅斑、水腫等皮膚變態(tài)反應(yīng)情況，青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑組極少數(shù)動(dòng)物除去藥物后有輕度紅斑和水腫反應(yīng)，反應(yīng)平均分值為0.2，致敏率為10%，至第24 h反應(yīng)均已消退。陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)明顯的紅斑、水腫等皮膚變態(tài)反應(yīng)情況，反應(yīng)平均分值高，在72 h觀察期內(nèi)致敏率達(dá)100%。3組豚鼠均未出現(xiàn)哮喘、站立不穩(wěn)等全身性過(guò)敏反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑及基質(zhì)對(duì)豚鼠皮膚基本上無(wú)致敏反應(yīng)。

表8 皮膚致敏反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表9 青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑對(duì)豚鼠皮膚致敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

青花椒超臨界提取物中含有大量揮發(fā)油，經(jīng)GC-MS分析，主要成分芳樟醇的占比達(dá)到74.16%，質(zhì)量濃度為13.57 mg/mL，其次為檸檬烯，占比5.45%，質(zhì)量濃度為1.75 mg/mL，可見(jiàn)芳樟醇在青花椒超臨界提取物占比很高，可能是其發(fā)揮藥效的成分。揮發(fā)油作為一類(lèi)性質(zhì)優(yōu)良的透皮吸收促進(jìn)劑，能促進(jìn)藥物透皮吸收、對(duì)皮膚刺激性小[26]。將其制備為熱熔壓敏膠貼劑，既能促進(jìn)自身擴(kuò)散，又可規(guī)避加熱揮發(fā)的問(wèn)題。

熱熔壓敏膠貼劑基質(zhì)的彈性體一般選用苯乙烯-丁二烯-苯乙烯（SBS）型和SIS型[27-28]。SIS中間嵌段聚異戊二烯結(jié)構(gòu)上具有側(cè)鏈甲基，使它具有很好的內(nèi)聚力和優(yōu)良的黏附性能以及與其他添加物良好的相容性[29]。與SBS相比，SIS具有融熔黏度低、低溫柔軟性能好、制膠透明度高等特點(diǎn)[30]，是制備熱熔壓敏膠基質(zhì)的首選。本研究采用經(jīng)典的Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)曲面法優(yōu)化熱熔壓敏膠貼劑基質(zhì)的組成，最終制備的基質(zhì)均勻性、涂展性、滲布程度、皮膚追隨性、剝離性、反復(fù)揭貼性與殘留量等感官評(píng)價(jià)良好，黏附性能適宜。載藥后的貼劑呈淡綠色透明狀，有淡清香味，貼敷后的綜合感官及黏附性能與空白基質(zhì)基本一致。

經(jīng)皮給藥是指將藥物貼劑貼附于皮膚后，藥物分子經(jīng)皮膚的角質(zhì)層、生長(zhǎng)表皮層和真皮層到達(dá)皮下組織，被淋巴管和毛細(xì)血管吸收進(jìn)入體循環(huán)的過(guò)程[31]，簡(jiǎn)而言之，是由濃度差推動(dòng)的被動(dòng)擴(kuò)散過(guò)程。貼劑的載藥量多采用體外吸收擴(kuò)散池法確定[32-33]，該方法雖簡(jiǎn)單易行，但無(wú)法真正模擬皮膚內(nèi)環(huán)境，所測(cè)得實(shí)驗(yàn)值與真實(shí)值存在一定偏差[1]，所以本實(shí)驗(yàn)選用在體實(shí)驗(yàn)篩選載藥量。

硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型是目前偏頭痛研究中常用的經(jīng)典模型[34-35]，硝酸甘油在體內(nèi)可生成一氧化氮（nitric oxide，NO），過(guò)量的NO會(huì)導(dǎo)致血管過(guò)度擴(kuò)張，進(jìn)而激活血管壁內(nèi)的傷害覺(jué)神經(jīng)纖維并介導(dǎo)降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）等血管活性物質(zhì)釋放，進(jìn)一步觸發(fā)血管周?chē)窠?jīng)源性炎癥參與偏頭痛的發(fā)生。該模型誘發(fā)的偏頭痛大鼠病理生理變化也與人類(lèi)偏頭痛相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將青花椒超臨界提取物制備為貼劑保留了其抗偏頭痛的藥效成分，隨著載藥量的增加，青花椒超臨界提取物貼劑抗偏頭痛效果增加，但當(dāng)載藥量增加至一定限度時(shí)，這種治療作用有所減弱。綜合考慮，最終確定青花椒超臨界提取物貼劑每貼載藥量為70 mg。

皮膚是藥物吸收的重要系統(tǒng)之一，也是人體的天然屏障[36]，可對(duì)外界刺激做出反應(yīng)，具有一定敏感性及自愈功能，因此考察貼劑經(jīng)皮給藥的安全性十分重要。本實(shí)驗(yàn)選用小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)、家兔皮膚刺激試驗(yàn)及豚鼠皮膚過(guò)敏性試驗(yàn)考察了青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑的安全性，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出該貼劑無(wú)急性毒性和致敏性，在家兔皮膚上出現(xiàn)了輕度刺激性，但在24 h內(nèi)自行消除，因此青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑安全性可靠。

目前偏頭痛的治療多采用口服給藥、針灸、按摩、芳香療法，或幾者相互配合應(yīng)用[20]，尚無(wú)貼劑的使用先例，本實(shí)驗(yàn)制備的青花椒超臨界提取物熱熔壓敏膠貼劑彌補(bǔ)了這一空缺。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該貼劑外觀性狀良好、黏附性能適宜且安全有效，可為患者提供新的用藥選擇。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of hot melt pressure sensitive adhesive patch with supercritical extract ofbased on migraine efficacy and its safety evaluation

YUAN Rui-fang1, YANG Jin-hui2, ZHANG Jin-ming1, HE Ya-nan1, REN Han1, ZHANG Ding-kun1, YANG Ming3

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Sichuan Baicao Jinggong Biotechnology Co., Ltd., Chengdu 610000, China 3. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

To optimize the forming process of hot-melt pressure-sensitive adhesive patch from the supercritical extraction part of, and evaluate the safety of the patch.Based on the sensory evaluation of uniformity, spreadability, degree of infiltration, skin followability, peelability, repeated peelability, and residual amount, as well as initial adhesion, holding adhesion and peeling strength as evaluation indexes, the matrix ratio of hot melt pressure sensitive adhesive was screened by single factor test and Box-Behnken design-response surface method. Theanimal evaluation method was used to screen the drug loading of the patch according to the number of head scratching in rats with nitroglycerin migraine. In addition, the safety of hot melt pressure sensitive adhesive was evaluated by mouse acute toxicity test, rabbit skin irritation test and guinea pig skin hypersensitivity test.The best matrix prescription of hot melt pressure sensitive adhesive was SIS (styrene-isoprene- styrene) elastomer: hydrogenated petroleum resin: liquid paraffin = 4:2:5.supercritical extract patch could significantly reduce the number of head scratching of migraine rats induced by nitroglycerin, 70 mg drug dosage of each gel patch could reduce the number of head scratching in rats by 81.75% within 30—60 min, which was preferably the best drug loading. The patch had no acute toxicity to mice, slightly irritated to the intact and damaged skin of New Zealand rabbits, eliminated itself within 6 h, and had no allergy to guinea pigs.The hot melt pressure sensitive adhesive for supercritical extraction ofprepared by this process has good sensory properties, strong adhesion, safe and effective.

Sieb. et Zucc.; supercritical fluid extraction; hot melt pressure sensitive adhesive; patch; migraine; molding process; safety evaluation; Box-Behnken design-response surface methodology; acute toxicity; skin irritation; skin sensitization

R283.6

A

0253 - 2670(2021)13 - 3841 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.008

2021-03-01

四川省中醫(yī)藥管理局花椒專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（2018HJZX023）；成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)學(xué)科特色創(chuàng)新科研團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（CXTD2018006）；成都中醫(yī)藥大學(xué)“杏林學(xué)者”學(xué)科人才科研提升計(jì)劃項(xiàng)目（BSH2018007）

袁瑞芳，女，碩士研究生，從事中藥藥劑學(xué)研究。Tel: 17393107011 E-mail: 1903023567@qq.com

張定堃，碩士生導(dǎo)師，副教授，從事中藥制劑與品質(zhì)評(píng)價(jià)新技術(shù)研究。Tel: 13568982018 E-mail: 465790643@qq.com

楊 明，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥炮制與制劑研究。Tel: 13870608983 E-mail: yangming16@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]