羅曉琴丁冠茗鄭 旭金京燕劉 陽張 楠王靖宇王愛國

(大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,遼寧大連 116044)

在我國,原發(fā)性肝細(xì)胞癌是僅次于胃癌和肺癌的第三大惡性腫瘤,因其患病人數(shù)多、生存期短、病死率高,被稱為“癌中之王”,是我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的重要攻關(guān)課題[1]。 建立體內(nèi)腫瘤動物模型是研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及腫瘤治療的重要方法,在腫瘤的基礎(chǔ)和臨床前研究方面,以及加快抗腫瘤藥物的研發(fā)和促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究等方面都具有重要的意義[2-3]。

肝的解剖位置和生理功能的特殊性決定了其不僅是人體最大的消化和代謝器官,也是重要的免疫器官。 由于肝直接接收來源于消化道的大量復(fù)雜營養(yǎng)物質(zhì),因而肝不僅要對病毒、細(xì)菌等有害抗原及時啟動免疫應(yīng)答,同時還要免疫耐受絕大多數(shù)無害性抗原。 肝特殊的免疫耐受狀態(tài)被認(rèn)為是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要病因[4]。 因而,肝的特殊生理學(xué)特點(diǎn)決定了肝原位移植性動物模型是研究肝癌病理機(jī)制和探索治療方案的重要體內(nèi)模型。 因此,建立肝原位移植性動物模型是肝癌的發(fā)病機(jī)制、侵襲、轉(zhuǎn)移,以及治療等研究的重要技術(shù)方法。

但在實(shí)際操作過程中,卻常因肝腫瘤細(xì)胞易從肝組織中溢漏,發(fā)生腹壁瘤、腹腔積液等情況,致使因肝內(nèi)接種的肝腫瘤細(xì)胞數(shù)量不一致和實(shí)驗(yàn)鼠體況差異增大,進(jìn)而導(dǎo)致肝移植腫瘤大小不一、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差波動范圍大和不確實(shí)等現(xiàn)象,無論是在動物福利方面,還是在動物實(shí)驗(yàn)中人、財、物和時間的投入方面都是重要的損失[5]。 因此,摸索出一套穩(wěn)定、高效、簡便易行的技術(shù)方法,是建立肝原位移植性腫瘤動物模型的實(shí)際需要。 本研究旨在建立一套高效、穩(wěn)定的建立肝原位移植性腫瘤動物模型的技術(shù)方法,以茲同行參考和交流。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級 C57BL/6J 雄鼠 24 只,12 周齡,體重(23±2)g,購買于大連醫(yī)科大學(xué)重大疾病基因工程模式動物研究所[SCXK(遼)2018-0003]。 小鼠飼養(yǎng)于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SYXK(遼)2018-0007]。 實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)條件嚴(yán)格按照SPF 級實(shí)驗(yàn)動物的規(guī)范要求。 飼喂的鼠糧為SPF 級小鼠AIN-93M標(biāo)準(zhǔn)飼料(脂肪占4%;碳水化合物占72.7%;蛋白質(zhì)占12.5%),飲用水為滅菌的純凈水。 小鼠按照簡單隨機(jī)法分為兩組,每組12 只,分別為棉壓組和熱封組。 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(AEE19065)。 實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守3R原則,且嚴(yán)格按照倫理要求控制移植腫瘤的長徑小于2 cm,體積小于2 cm3。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠肝癌細(xì)胞株H22 由大連醫(yī)科大學(xué)張宏穎教授贈予。

1.2 主要試劑與儀器

1640 培養(yǎng)基(Gibico);FBS(Gibico);1%青霉素和鏈霉素(碧云天公司);1.75%阿弗丁(2, 2, 2-Tribromoethanol,75-80-9,Sigma 公司);4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司);低生長因子Matrigel 基質(zhì)膠(康寧公司)等。 二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-20AIC);超凈工作臺(ESCO,AC2-6S1);倒置顯微鏡(NOVEL,河南兄弟儀器設(shè)備有限公司);Vortex 振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

(1)一次性無菌醫(yī)用棉棒(江西松鶴醫(yī)療器械有限公司);1 mL 和10 mL 注射器(鎮(zhèn)江康利醫(yī)療器械有限公司);10 μL 微量注射針(上海高鴿工貿(mào)有限公司);微創(chuàng)手術(shù)剪;微創(chuàng)鑷子;止血鉗;寵物剃毛器;體視顯微鏡;針型電烙鐵(深圳市白光電子科技有限公司);縫合針;醫(yī)用真絲編織線(縫合線,規(guī)格4-0,黑色,產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號 YZB/滬0645-65-2005,上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)。

(2)自制手術(shù)輔助工具:直徑為0.5 cm 的墊背小木棒;撐開胸腔的帶線小金屬細(xì)彎鉤;長度為1 cm 的固定小棒(圖1)。

圖1 自制手術(shù)輔助工具Figure 1 Self-made auxiliary tools for surgery

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 H22 細(xì)胞的準(zhǔn)備

將H22 細(xì)胞從液氮罐中取出,在37℃水浴鍋中晃動將細(xì)胞解凍,把細(xì)胞懸液移入含有7~8 mL 的37℃完全培養(yǎng)液的15 mL 離心管中,1000 r/min 離心5 min,棄上清,加入新的培養(yǎng)液,吹打混勻,移入培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱(37℃,5% CO2)中培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng)3 代后,當(dāng)細(xì)胞處于旺盛、穩(wěn)定的生長狀態(tài),可用于肝原位移植性實(shí)驗(yàn)。 調(diào)整細(xì)胞濃度:每毫升1×108個,和 Matrigel 基質(zhì)膠按照 4 ∶1混合均勻,置于冰上等待后續(xù)注射實(shí)驗(yàn),使用前Vortex 振蕩混勻。

1.3.2 肝原位移植性腫瘤動物模型的制備

(1)小鼠在手術(shù)前提前禁水糧4 h,小鼠稱重,按0.25 mL/10 g 體重腹腔注射麻醉藥阿弗丁,麻醉后使用寵物剃毛刀剃去腹部手術(shù)部位的毛,將小鼠固定于泡沫板制成的手術(shù)臺上(圖2)。

(2)剃毛并依次使用碘伏和75%乙醇對腹部備皮部位進(jìn)行消毒,用眼科剪沿腹部正中線從劍突向下做一約1.5~2.0 cm 的縱向切口,暴露劍突(圖2)。

(3)用帶線小金屬細(xì)彎鉤將切口兩側(cè)皮層與肌層一同分別拉向切口兩側(cè),固定拉鉤。 將一個直徑為2 cm 的小棒墊于小鼠背部肝上緣以便充分暴露肝,觀察小鼠肝的解剖結(jié)構(gòu)是否正常,手指輕壓兩側(cè)肋弓以擠出部分肝左葉(圖2)。

圖2 手術(shù)小鼠固定方法Figure 2 Fixation method of surgical mice

(4)調(diào)整立體顯微鏡的焦距,使肝左葉清晰地暴露在顯微視眼下,使用Vortex 將細(xì)胞振蕩混勻后,使用規(guī)格為10 μL 的微量注射針緩慢吸取5 μL細(xì)胞液。 微量注射針的針頭與肝表面呈20 度角進(jìn)針,進(jìn)針后使針頭與桌面平行,平行推進(jìn)約1 cm(針尖的最終位置不宜太過靠近肝葉邊緣薄處),緩慢注入5 μL H22 細(xì)胞懸液,可觀察到注射區(qū)域大部肝葉顏色迅速變淺(白斑)或出現(xiàn)渾濁的半透明空泡。

(5)注射后針體停留1 min,再緩慢退出白斑或空泡區(qū)域,退出該區(qū)域后等待2~4 min,退出全針。為防止腫瘤細(xì)胞從針孔溢漏,我們依據(jù)采用的應(yīng)對方法的不同,分為棉壓組和熱封組。 棉壓組小鼠在退針后迅速使用無菌棉簽壓迫進(jìn)針口,直至無出血情況后移走棉簽。 熱封組小鼠在退針后使用無菌棉簽迅速壓迫進(jìn)針口的同時,使用針型電烙鐵輕輕灼燒封閉針孔。

(6)用蘸取75%乙醇的棉棒輕輕擦拭肝葉表面后,將肝左葉輕緩地移回腹腔。

(7)根據(jù)稱量的小鼠體重值,向腹腔注射濃度為 8 μg/μL 的慶大霉素(5 mL/kg),使用 4-0 非吸收性縫合線依次縫合腹膜和皮膚。

(8)縫合完畢后,使用75%乙醇擦拭縫合的切口及周圍的皮膚,將小鼠放置于35℃加熱墊上待其復(fù)蘇。 完全復(fù)蘇后,移入飼養(yǎng)盒內(nèi)進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.3 術(shù)后觀察及檢測

(1)日常觀察:小鼠術(shù)后的生活狀態(tài),進(jìn)食、飲水、活躍健康狀況,異常死亡情況等。

(2)樣本取材:第19 天處死小鼠,解剖取出肝稱重拍照,分離腫瘤組織稱重并拍照,同時使用游標(biāo)卡尺測量每只小鼠腫瘤的長徑(a)和短徑(b),按公式:V=ab2/2 計算腫瘤體積。

(3)病理學(xué)檢測:腫瘤組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定后做病理學(xué)檢測,常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、制片(4 μm),HE 染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

肝重數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 兩組比例差異應(yīng)用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型鼠的存活狀態(tài)

在術(shù)中均未見死亡,并于術(shù)后2~3 h 后蘇醒。模型鼠術(shù)后存活狀況良好,1 d 后活動正常,5 d 后手術(shù)刀口恢復(fù)。 在5~18 d 的飼養(yǎng)過程中,棉壓組和熱封組小鼠的存活率均為91.7%,各有1 只小鼠在后期的飼養(yǎng)過程中死亡,剖檢時發(fā)現(xiàn)死亡小鼠的結(jié)腸內(nèi)有大量內(nèi)容物聚集,結(jié)腸腫脹,可能是由于麻醉時針刺損傷、麻醉藥作用、術(shù)中機(jī)械牽拉刺激或腫瘤壓迫等因素導(dǎo)致排便功能異?；蚵楸孕阅c梗阻所致,食物殘渣不能正常排出,導(dǎo)致代謝功能紊亂而最終死亡。

2.2 模型鼠肝腫瘤成瘤情況

接種后第19 天對模型鼠進(jìn)行剖檢,觀察肝移植瘤的成瘤情況。 肝內(nèi)肉眼可見明顯的移植瘤,瘤形狀相對規(guī)則,呈白色的橢圓或者長條形(圖3、圖4)。 結(jié)果表明,移植瘤小鼠的成瘤率為100%。

圖3 移植瘤實(shí)體表觀Figure 3 A representative physical photograph of transplanted liver tumor

腫瘤測量結(jié)果顯示,棉壓組小鼠的腫瘤最大長徑為1.83 cm,平均體積為(0.27 ± 0.16)cm3,平均重量為(0.19 ± 0.07)g;熱封組小鼠的腫瘤最大長徑為1.75 cm,平均體積為(0.34 ± 0.09)cm3,平均重量為(0.18 ± 0.02)g。 兩組小鼠的腫瘤大小和腫瘤重量雖無統(tǒng)計學(xué)差異,但與棉壓組相比較,熱封組的肝移植瘤的大小均一,腫瘤重量的波動性小(圖4)。 另外,在剖檢時發(fā)現(xiàn),棉壓組出現(xiàn)了高比率的腹水(36.4%)和腹壁瘤(36.4%)(圖5),而熱封組沒有出現(xiàn)上述現(xiàn)象,兩組統(tǒng)計學(xué)差異顯著(表1)。說明棉壓組的腫瘤細(xì)胞從注射孔溢漏的情況顯著增高,這也是棉壓組肝移植瘤大小波動性較大的根本原因。 另外,在棉壓組還發(fā)現(xiàn)1 只發(fā)生腹水的小鼠出現(xiàn)肝內(nèi)多個腫瘤結(jié)節(jié)(圖6),這可能是腹水瘤細(xì)胞通過脈管系統(tǒng)形成的肝轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。

圖6 腫瘤細(xì)胞的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移Figure 6 Intrahepatic metastasis of tumor cells

表1 棉壓組和熱封組小鼠生存和腫瘤情況的比較Table 1 Comparison of survival and tumor status of mice between cotton-pressed group andheat-sealed group

圖4 移植瘤大小及重量的波動范圍Note. A, Physical photographs of transplanted tumors. B, Fluctuation range of transplanted tumor volume. C,Fluctuation range of transplanted tumor weight.Figure 4 Fluctuation ranges of size and weight of the transplanted tumors

圖5 棉壓組出現(xiàn)的腹水和腹壁瘤Note. A, Ascites in the cotton-pressed group. B, Abdominal wall tumor in the cotton-pressed group.Figure 5 Ascites and abdominal tumor appeared in the cotton-pressed group

2.3 病理學(xué)檢測

病理學(xué)檢測結(jié)果表明(圖7),雖然棉壓組與熱封組在腫瘤大小的波動性上有明顯的不同,但在病理學(xué)表型上沒有顯著差異。 HE 染色光鏡下觀察,癌細(xì)胞排列緊密,表面不規(guī)則,異型性明顯,分化程度差,核深染,呈現(xiàn)分葉及多核現(xiàn)象,游離核糖體增多,腫瘤邊緣浸潤肝組織。

圖7 肝原位移植性腫瘤的病理學(xué)檢測Figure 7 Pathological examination of orthotopic liver transplanted tumors

3 討論

動物模型應(yīng)該盡可能地接近人類腫瘤的自然生物學(xué)過程。 腫瘤模型主要包括自發(fā)性、移植性、化學(xué)性誘發(fā)性和轉(zhuǎn)基因腫瘤模型,這些腫瘤動物模型已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于腫瘤發(fā)生和發(fā)展分子機(jī)制的研究中[6-8]。 因自發(fā)性和轉(zhuǎn)基因腫瘤模型具有遺傳性特征,局限于特定的遺傳特質(zhì)或人為遺傳修飾的動物模型,應(yīng)用范圍有限。 由于移植性和化學(xué)性誘發(fā)性腫瘤動物模型的建立具有易于獲取實(shí)驗(yàn)動物和相對技術(shù)難度小等特點(diǎn),是目前實(shí)驗(yàn)室普遍應(yīng)用的腫瘤動物模型。 雖然誘發(fā)性腫瘤動物模型與自然腫瘤發(fā)生過程相近,但具有實(shí)驗(yàn)周期長、個體差異大、致死性高、實(shí)驗(yàn)動物用量大等缺點(diǎn)[9]。 而移植性腫瘤動物模型因其具有實(shí)驗(yàn)周期短、個體差異小、致死性低、實(shí)驗(yàn)動物用量少等優(yōu)點(diǎn),已成為實(shí)驗(yàn)室最常用的腫瘤動物模型[10]。

移植性腫瘤動物模型主要分為皮下移植性和原位移植性兩種[11]。 與原位腫瘤移植模型相比,雖然皮下腫瘤移植模型操作簡單、技術(shù)難度小、成功率高、易于觀測和局部干預(yù),但存在因血液供應(yīng)不足而發(fā)生后期的皮膚破潰和中心組織壞死;因被膜相對完整而局限于皮下,缺乏周圍組織浸潤及遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,不能很好地模擬腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的病理生理學(xué)過程等缺點(diǎn)[12-13]。 特別是忽略了腫瘤與周圍正常組織的相互作用關(guān)系,在組織細(xì)胞的生物學(xué)環(huán)境、免疫環(huán)境、腫瘤形成、病理生理學(xué)變化等方面仍存在較大的差異,不能很好地模擬腫瘤的自然生物學(xué)過程,有一定的局限性[14-16]。 原位移植性腫瘤模型可有效克服皮下移植瘤的缺點(diǎn),是目前腫瘤研究中較為理想的基礎(chǔ)體內(nèi)動物模型。

由于野生型小鼠具有完全的免疫能力,因而應(yīng)用H22 等鼠源性肝癌細(xì)胞制備野生型小鼠的肝原位移植性肝癌動物模型是實(shí)驗(yàn)室常用的研究方案[17-18]。 但H22 肝癌細(xì)胞屬于種植腹水型肝癌細(xì)胞,具有擴(kuò)增速度快,容易擴(kuò)散的特點(diǎn)。 在制作肝原位移植性腫瘤動物模型過程中,除了因?yàn)闊o法很好地解決肝腫瘤細(xì)胞濃度、注射體積、壓迫肝止血和防止腫瘤細(xì)胞溢漏等問題,從而導(dǎo)致肝原位移植瘤大小不均一的現(xiàn)象,還常出現(xiàn)腹水和腹壁瘤等附加異位接種等情況,極大地影響了最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計和判定[19]。 有些學(xué)者為了避免上述現(xiàn)象,采用先建立皮下移植腫瘤,然后取出皮下移植的腫瘤組織將其切成小塊(2 mm × 2 mm × 1 mm 左右),再采取肝內(nèi)隧道植入法移植到肝內(nèi)。 但這個方法操作難度大,容易造成動物肝大量出血并引起動物死亡,同時手術(shù)時間較長,具有較大的操作難度,在人員有限的情況下不適用于制備大批量的肝原位移植性腫瘤動物模型,影響荷瘤成功率[20]。

為解決上述難點(diǎn),本研究通過對實(shí)驗(yàn)方法和細(xì)節(jié)的不斷摸索和多次改進(jìn),建立了一種簡易、有效、穩(wěn)定、可行性高的原位移植性肝癌的方法,總結(jié)經(jīng)驗(yàn)要點(diǎn)如下:

(1)保持高細(xì)胞活性。 體外培養(yǎng)H22 懸浮細(xì)胞可保證細(xì)胞的高純度和高活性。

(2)手術(shù)視野要寬闊。 腹部切口適度(1.5~2 cm),同時用自制器材拉開腹皮,以便充分暴露肝,便于操作。

(3)選擇微量注射器。 使用細(xì)的微量注射針將細(xì)胞緩緩注入小鼠肝,可減輕針頭對肝的損傷,減少針口面積,提高實(shí)驗(yàn)成功率。

(4)嚴(yán)格控制注射體積。 為避免注入肝的細(xì)胞混懸液因壓力過大而發(fā)生溢漏,形成腹壁瘤或腹腔積液的現(xiàn)象,可使用10 μL 微量注射針向肝注射5 μL 細(xì)胞懸液,盡可能減少注射體積。

(5) 應(yīng)用 Matrigel 基質(zhì)膠。 將細(xì)胞懸液和Matrigel 基質(zhì)膠混勻,可避免在原位接種細(xì)胞懸液的彌散,有效地形成實(shí)體瘤。

(6)注意進(jìn)針的角度和深度。 C57BL/6J 小鼠肝較薄,進(jìn)針角度過大極易穿透肝,從而引起腹腔種植,導(dǎo)致接種的失敗。 在實(shí)驗(yàn)過程中需將針尖與肝表面呈20 度進(jìn)針,針尖行程約為1.0 cm,可有效保證所注射的細(xì)胞位于肝左外側(cè)葉實(shí)質(zhì)內(nèi)。

(7)選擇合適大小的小鼠。 在小鼠的選取上,盡量使用自然生長環(huán)境下的雄性 C57BL/6J 小鼠,出生在 12~15 周,體重在(23 ± 2)g 為宜,避免肝葉太小影響細(xì)胞注射過程增大手術(shù)難度,也可避免性激素可能對肝移植瘤生長的影響。

(8)清除殘余腫瘤細(xì)胞。 使用針型電烙鐵灼燒針孔后,要用酒精棉球輕擦針孔周圍及肝表面,防止少量遺漏的腫瘤細(xì)胞異位種植于腹壁或腹腔內(nèi)。

(9)術(shù)前禁水禁糧。 在進(jìn)行手術(shù)前4 h 對小鼠禁水禁糧,避免麻醉時的不良反應(yīng)。

(10)謹(jǐn)慎柔和操作。 在手術(shù)操作的過程中要輕柔、謹(jǐn)慎,避免損傷其他臟器。

(11)縫合打結(jié)后線頭要留0.3 cm 左右。 小鼠腹皮縫合時,縫合打結(jié)后,線頭要留的長一些,避免小鼠蘇醒后在活動或啃咬中解開,導(dǎo)致胃腸和肝暴露而死亡。

本研究探索出制備均一、穩(wěn)定肝原位移植性腫瘤動物模型的技術(shù)方法并總結(jié)其實(shí)施要點(diǎn),具有時間短,易操作,模型穩(wěn)定性高等特點(diǎn),以茲與肝癌研究的同仁進(jìn)行交流和相互借鑒。