柴雅靜，余曉雪，楊 琨,2*，喬自林,2,3

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心/甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心/生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）又稱為促血管因子（vascul-otropin，VAS），它對血管內(nèi)皮細胞的增殖分裂等起到促進作用，可以使血管對一些大分子物質(zhì)的通透性增強，刺激新血管生成，在生殖過程中也具有獨特作用[1-3]。形態(tài)學(xué)研究證明，卵泡的發(fā)育和血管的發(fā)生是密不可分的。卵泡周圍的血管網(wǎng)越密集，卵泡可吸收的營養(yǎng)就越多，發(fā)育就越快。反之，發(fā)育受阻形成閉鎖卵泡[4]。

該實驗以綿羊卵巢為實驗材料，通過HE染色和免疫組織化學(xué)染色的方法檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在綿羊卵巢中的表達及定位的特異性，為綿羊卵巢的卵泡發(fā)育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

該實驗所需材料為綿羊的卵巢，于甘肅省蘭州市屠宰場采集健康綿羊卵巢組織樣本，經(jīng)宰割后立即采取組織樣本并放入4%多聚甲醛中固定。

1.2 材料處理

按照石蠟包埋的常規(guī)方法先取綿羊卵巢組織中的卵泡，對其形狀修整后進行石蠟包埋，切成厚度為4～5 μm的組織切片，最后對切片進行HE染色以及免疫組織化學(xué)染色。

1.3 主要試劑

兔SP試劑盒（SP-0023）、VEGF多克隆抗體（兔）（bs-1665R）以及DAB染色試劑盒（C02-04001），均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 HE染色

將已經(jīng)固定好的卵巢組織用水沖洗、梯度脫水、透明后進行浸蠟包埋，制作組織切片，然后進行脫蠟水化、染色、分化、脫水透明、封片等HE常規(guī)染色步驟。鏡下觀察綿羊卵巢組織結(jié)構(gòu)的完整性及其結(jié)構(gòu)特點。

1.5 免疫組織化學(xué)SP染色

將組織切片脫蠟水化，隨后抗原修復(fù)、阻斷、封閉，而后滴加一抗置于濕盒內(nèi)4℃過夜孵育，PBS緩沖液洗滌后用二抗孵育。配置DAB顯色液進行顯色并觀察，顯色終止后用蘇木精進行復(fù)染，封片鏡檢。

1.6 結(jié)果判定

鏡檢結(jié)果中，DAB顯色陽性表達為棕黃色，通過棕黃色表達的深淺及面積可判斷VEGF表達的強弱。

2 結(jié)果

2.1 綿羊卵巢的組織學(xué)結(jié)構(gòu)

圖1A可見初級卵泡，結(jié)構(gòu)完好，初級卵母細胞與卵泡細胞之間有透明帶，卵泡周圍有卵泡膜[5]。圖1B可見次級卵泡，卵泡細胞間出現(xiàn)腔隙（卵泡腔），可見卵丘[6,7]。由此可知，該綿羊卵巢結(jié)構(gòu)完好，發(fā)育健康良好，無不良病變。

圖1 綿羊卵巢組織HE染色結(jié)果

2.2 血管內(nèi)皮生長因子在綿羊卵巢中的表達

在綿羊卵巢中，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示VEGF主要在各級卵泡中表達。由圖2可知，VEGF在原始卵泡、初級卵泡以及次級卵泡中都為陽性表達。由表達的深淺不同可知，VEGF在次級卵泡中表達最強，初級卵泡中表達效果次之，原始卵泡中表達最弱，且VEGF主要在初級卵泡和次級卵泡的顆粒細胞以及卵泡膜細胞的胞質(zhì)中表達，在細胞核內(nèi)無表達。

圖2 綿羊卵巢免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果

3 討論

血管內(nèi)皮生長因子是關(guān)于血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。血管在卵泡發(fā)育初期就開始生成，且在整個卵泡發(fā)生過程中是持續(xù)的。卵巢中卵泡的發(fā)育可分為籌募、選擇和優(yōu)勢化3個過程。在卵泡優(yōu)勢化時期，高表達量的VEGF會促進血管的生成，給正在發(fā)育的卵泡提供更為豐富的營養(yǎng)，使卵泡更加快速地生長發(fā)育[8]。

排卵前，卵泡的膜細胞層中會形成大量血管，由于VEGF的表達強度與卵泡中的血管生成和發(fā)育有著密切關(guān)聯(lián)[9]，因此可推測本研究結(jié)果中顆粒細胞和膜細胞分泌的VEGF可能促進了膜細胞層血管內(nèi)皮細胞的增殖。

1999年，Otani[9]等人通過免疫組織化學(xué)方法研究證實，在人的卵泡中VEGF是存在免疫定位的。VEGF在小腔卵泡的顆粒細胞中表達較弱，在中型卵泡的膜細胞中表達較強，其顆粒細胞和卵泡膜細胞的表達強度會隨著卵泡的生長發(fā)育逐漸增強。本實驗認為VEGF在綿羊卵巢中的表達主要分布于各級卵泡，其中在竇腔期卵泡中的表達比原始卵泡中多，且VEGF主要在顆粒細胞以及卵泡膜細胞的胞質(zhì)中表達。

4 結(jié)語

血管內(nèi)皮生長因子在綿羊卵巢中的表達主要位于顆粒細胞以及卵泡膜細胞的胞質(zhì)中，細胞核內(nèi)無VEGF表達，推測顆粒細胞和膜細胞分泌的VEGF可能促進了膜細胞層血管內(nèi)皮細胞的增殖，能夠為綿羊的繁殖機理及其卵泡發(fā)育的調(diào)控提供理論參考。