唐惠明，戰(zhàn)明月，張浩然，徐佳慧，楊 卓，楊 萍

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132101）

牛血是典型的堿性食物，能夠維持人體的酸堿平衡、提高人體免疫力，減少常見(jiàn)疾病的發(fā)生。牛血中含有微量元素鐵，對(duì)貧血、血虛、閉經(jīng)等具有一定的治療效果[1]。牛血還具有非常好的排毒效果，有利于清除人體內(nèi)堆積的毒素。新鮮牛血中含有的多肽具有抗菌活性，對(duì)真菌、原蟲(chóng)、病毒及癌細(xì)胞等具有較強(qiáng)的殺傷消滅作用[2]。因此，有必要開(kāi)發(fā)、研究出一種從牛血中提取、純化抗菌肽的方法。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

1.1.1 原料 從屠宰場(chǎng)取新鮮黃牛血，加入食鹽防止牛血因凝固而分離不出白細(xì)胞。用200目的紗網(wǎng)過(guò)濾，將黃牛血中的不溶物去除。

1.1.2 試劑 氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、異辛烷、CTAC（氯化十六烷基三甲基銨）、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、硼酸、鹽酸、甲基紅、溴甲酚綠、乙醇、酵母菌、酵母浸膏、麥芽粉、明膠。

1.2 儀器

離心機(jī)、恒溫?fù)u床、高壓滅菌鍋、凱式定氮蒸餾裝置、微生物培養(yǎng)箱、透析袋。

1.3 試驗(yàn)方法

原料處理→分離白細(xì)胞→白細(xì)胞的破碎→反膠束相系統(tǒng)的萃取→反膠束系統(tǒng)的反萃取→抗菌肽純化→得到抗菌肽。

分離白細(xì)胞：取黃牛血加入3%明膠鹽水溶液（選取優(yōu)質(zhì)明膠，用生理鹽水配成3%溶液），比例為1∶1，于燒杯中混勻。明膠能與紅細(xì)胞發(fā)生粘合作用，使得紅細(xì)胞快速下沉，白細(xì)胞則留在明膠溶液中。用毛細(xì)吸管吸取上層清液，放入另一燒杯中。取上述溶液20 ml，加入無(wú)Ca2+、Mg2+的Hank's液[3]至離心管口3 cm處，混勻，以水平離心機(jī)2 000 r/min離心10 min，棄上清，同法2次[4]。

白細(xì)胞破碎：用超聲儀裂解細(xì)胞，將細(xì)胞水溶液放入超聲儀中，選用適當(dāng)?shù)墓β剩呀狻?/p>

反膠束系統(tǒng)的萃?。? g CTAC置于錐形瓶中，加入100 ml異辛烷，磁力攪拌使表面活性劑完全溶解。加入4 ml 0.01 mol/L的KCl溶液，用KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液調(diào)節(jié)，使pH=7，搖床振蕩2 h。然后用離心機(jī)以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，溶液若透明，則萃取成功[5]。用Na2HPO4和NaH2PO4分別配制pH=5.5、6.0、6.7、7.1、7.3的緩沖液[6]；將反膠束溶液與白細(xì)胞破碎溶液按1∶1加入試管中，振蕩搖勻，調(diào)節(jié)適宜的pH；控制溫度、時(shí)間、振蕩頻率，置于恒溫?fù)u床中，使抗菌肽轉(zhuǎn)移到反膠束溶液中。

反膠束系統(tǒng)的反萃取：配制pH為10.1～10.3的Na2CO3/NaHCO3反萃取緩沖液，緩沖溶液中乙醇含量為4%，氯化鉀的濃度為1.2 mol/L[7]。萃取完后取有機(jī)相于離心管中，加入等體積的反膠束萃取溶液，振蕩，使其充分混勻。將反萃取后的液體等量放入離心機(jī)試管內(nèi)，轉(zhuǎn)速2 000 r/min，按離心機(jī)操作設(shè)置好時(shí)間即可。離心后用膠頭滴管吸出反膠束，重復(fù)離心2次，得到抗菌肽水溶液，將抗菌肽水溶液加熱干燥，溫度不可超過(guò)110℃，冷卻后即可得到抗菌肽[8]。

1.4 抗菌肽的純化及定量

選擇截留分子量500規(guī)格的透析袋剪取15 cm，在2%碳酸氫鈉和1 mo1/LEDTA(pH=8.0)的溶液中將透析袋煮沸10 min后用冷水徹底清洗。再放在1 mo1/LEDTA（pH=8.0）中將之煮沸10 min，冷卻。將抗菌肽水溶液放入處理好的透析袋內(nèi)，透析袋內(nèi)留30%～50%的空間，將空氣擠出后放入透析液（10 g NaHCO3+186.6 mg EDTA-2Na+500 ml蒸餾水）中4℃透析，通常4 h左右內(nèi)外濃度達(dá)到平衡，因此每隔4～5小時(shí)換透析液1次，即得抗菌肽[9]，凱式定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.5 抗菌肽抑菌效果的定性檢測(cè)

燒杯中加入1 L的純凈水、3 g麥芽粉、0.1 g酵母浸膏，pH調(diào)為7.2，配置好后放入錐形瓶密封，用蒸汽滅菌（121℃、30 min），冷卻后加入1 g酵母粉37℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液倒入6個(gè)培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)基20 ml，分為2組，每組各1個(gè)培養(yǎng)基中加入提取物，培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察酵母菌細(xì)胞數(shù)目，根據(jù)數(shù)目多少判定抑菌效果[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)抗菌肽萃取效果的影響

取裂解后的白細(xì)胞溶液各10 ml，分別置于5支試管中，加入配置好的萃取緩沖液，調(diào)節(jié)pH值分別為6.1、7.5、8.4、9.7、10.3。各試管置于恒溫儀（20℃）中，振蕩頻率120 r/min、萃取時(shí)間25 min、超聲波的頻率24 kHz，按照超聲波輔助反膠束萃取黃牛血抗菌肽工藝研究中的步驟萃取出抗菌肽。根據(jù)測(cè)定的總氮量，pH值對(duì)抗菌肽提取的影響如圖1所示。

圖1 pH值對(duì)總氮量的影響

由圖1可知，在pH值從6.1逐漸增加到9.7的過(guò)程中，隨著溶液pH值的增加，總氮量明顯增加；當(dāng)pH值超過(guò)9.7時(shí)，總氮量開(kāi)始下降。造成這種結(jié)果的原因可能是抗菌肽是一種堿性多肽，pH值的增加使抗菌肽的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，從而使總氮量增加；pH值超過(guò)9.7時(shí)OH-含量過(guò)多，影響反膠束體系的穩(wěn)定性，導(dǎo)致總氮量下降。

2.2 萃取溫度對(duì)抗菌肽提取的影響

白細(xì)胞分離過(guò)程中超聲波的頻率為24 kHz，萃取時(shí)恒溫儀的振蕩頻率為120 r/min、萃取pH值為10.3、萃取時(shí)間為25 min。溫度分別設(shè)為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃。根據(jù)測(cè)定的總氮量，萃取溫度對(duì)抗菌肽提取的影響如圖2所示。

圖2 萃取溫度對(duì)總氮量的影響

由圖2可知，總氮量隨著萃取溫度的升高而升高。溫度由15℃升至25℃時(shí)總氮量明顯增加，當(dāng)溫度超過(guò)25℃后總氮量雖有所增加，但不是特別明顯。溫度越高分子動(dòng)能越大，分子運(yùn)動(dòng)速度越快，使反膠束分子與樣品溶液中蛋白質(zhì)的接觸更加頻繁，使得總氮量增加；當(dāng)溫度超過(guò)25℃時(shí)，溫度對(duì)提取效果的影響快達(dá)到臨界值，溫度的升高對(duì)總氮量的影響不顯著。

2.3 萃取時(shí)間對(duì)抗菌肽提取的影響

白細(xì)胞分離過(guò)程中超聲波的頻率為24 kHz、恒溫儀的振蕩頻率為120 r/min，萃取時(shí)pH為10.3、溫度為20℃，萃取時(shí)間分別為15 min、20 min、25 min、30 min、35 min。根據(jù)測(cè)定的總氮量，萃取時(shí)間對(duì)抗菌肽提取的影響如圖3所示。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)總氮量的影響

由圖3可知，總氮量隨著萃取時(shí)間的增加而增加。萃取時(shí)間為15～30 min時(shí)總氮量明顯增加，反膠束溶液與樣品溶液接觸時(shí)間增加，使更多的蛋白質(zhì)進(jìn)入到反膠束溶液中；當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)30 min時(shí)，萃取時(shí)間對(duì)總氮量的影響接近臨界值，所以在30 min后萃取時(shí)間對(duì)總氮量的影響不顯著。

2.4 白細(xì)胞分離過(guò)程中超聲波的頻率對(duì)抗菌肽提取的影響

恒溫?fù)u床振蕩頻率為120 r/min、pH為10.3、萃取溫度為20℃、萃取時(shí)間為25 min，超聲波的頻率分別為8 kHz、16 kHz、24 kHz、32 kHz、40 kHz。通過(guò)測(cè)定總氮量，白細(xì)胞分離過(guò)程中超聲波的頻率對(duì)抗菌肽提取的影響如圖4所示。

圖4 超聲波頻率對(duì)總氮量的影響

由圖4可知，總氮量隨著超聲波頻率的增大而增加。超聲波頻率未達(dá)到32 kHz前，樣液中細(xì)胞破裂程度隨著超聲波頻率的增大而增大，細(xì)胞的破裂使抗菌肽流出，沒(méi)有了細(xì)胞膜的阻擋，使得抗菌肽能直接與反膠束溶液接觸，從而使提取液中的總氮量增加，超聲波頻率對(duì)總氮量有明顯影響；超聲波頻率超過(guò)32 kHz后，細(xì)胞幾乎被裂解完畢，超聲波頻率對(duì)總氮量無(wú)顯著影響。

2.5 萃取時(shí)恒溫儀振蕩頻率對(duì)抗菌肽提取的影響

白細(xì)胞分離過(guò)程中超聲波的頻率為24 kHz，萃取時(shí)pH為10.3、溫度為20℃、萃取時(shí)間為25 min，萃取時(shí)恒溫儀的振蕩頻率分別為40 r/min、80 r/min、120 r/min、160 r/min、200 r/min。通過(guò)測(cè)定總氮量，恒溫?fù)u床振蕩頻率對(duì)抗菌肽提取的影響如圖5所示。

圖5 恒溫?fù)u床振蕩頻率對(duì)總氮量的影響

由圖5可知，總氮量隨著恒溫?fù)u床振蕩頻率的增加而增加。在恒溫?fù)u床振蕩頻率未達(dá)到160 r/min之前，恒溫?fù)u床振蕩頻率對(duì)總氮量有顯著影響，恒溫?fù)u床在試驗(yàn)過(guò)程中的作用主要是控制提取溫度與攪拌，恒溫?fù)u床頻率的增加使反膠束溶液與樣液的接觸更加快速，從而使總氮量增加；在恒溫?fù)u床頻率達(dá)到160 r/min后，恒溫?fù)u床振蕩頻率對(duì)總氮量的影響達(dá)到臨界值，對(duì)總氮量的影響不顯著。

2.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.7 方差分析

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行spss分析（見(jiàn)表2），并編制因素水平表（見(jiàn)表3）。

表2 主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)

表3 因素水平

由表2可知，pH值、萃取溫度、萃取時(shí)間、超聲波頻率、恒溫?fù)u床振蕩頻率對(duì)總氮量均有顯著影響。根據(jù)方差分析中的交互作用及實(shí)際操作方便、經(jīng)濟(jì)、節(jié)省開(kāi)支等既定條件，pH值9.7、萃取溫度35℃、萃取時(shí)間35 min、恒溫?fù)u床振蕩頻率160 r/min、超聲波頻率32 kHz為科學(xué)的提取條件。

2.8 抗菌肽抑菌效果的定性檢測(cè)

抗菌肽的抑菌效果見(jiàn)圖6、圖7，圖6的酵母菌數(shù)目遠(yuǎn)大于圖7，即在酵母菌培養(yǎng)過(guò)程中，加入提取液的培養(yǎng)皿酵母數(shù)目明顯少于未加提取液的培養(yǎng)皿酵母數(shù)目，說(shuō)明試驗(yàn)提取出來(lái)的物質(zhì)具有抗菌效果。

圖6 未加提取液的酵母菌

圖7 加提取液的酵母菌

3 結(jié)論

本研究以黃牛血為原料采用反膠束法進(jìn)行提取，得到抗菌肽最佳提取工藝的pH為9.7、萃取溫度為35℃、萃取時(shí)間為35 min、恒溫?fù)u床振蕩頻率為160 r/min、超聲波頻率為32 kHz，總氮量達(dá)到0.99 mg，抗菌肽的抑制酵母菌效果較好。