魏雪玲，蘭美，彭新皓，張菡奕，龍恩，劉會，郎錦義,

0 引言

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是華南地區(qū)最重要的頭頸部惡性腫瘤，放射治療為主要治療方法。隨著放療技術的發(fā)展和化療方案的不斷完善，鼻咽癌生存率得到改善，目前5年OS高達80%[1]。盡管鼻咽癌對放化療敏感，但仍有20%～30%患者發(fā)生局部復發(fā)或遠處轉移[2]。

NPC的發(fā)病機制與愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus,EBV）密切相關，其中EBV致癌作用的潛在機制涉及LMP1、LMP2、microRNA等物質[3]。目前血漿中循環(huán)EBV DNA載量已被確定為NPC的腫瘤標志物，也被廣泛確立為篩查、監(jiān)測和預測NPC疾病進展的重要標志[4]。病毒能夠感染刺激機體產生免疫效應，除一些非特異的免疫外，也有特異性免疫的產生[5]。特異性免疫包括細胞免疫和體液免疫，在病毒感染的情況下，外周血免疫細胞的比例將發(fā)生明顯改變，而大量研究顯示免疫細胞的變化能夠直接影響腫瘤患者的預后。早期研究中，主要影響鼻咽癌預后的外周血免疫細胞包括：CD8+T淋巴細胞比例、CD44+T淋巴細胞比例、CD4+/CD8+比值等[6-8]。

目前，免疫治療在鼻咽癌治療中越來越受重視，免疫療法的提出為鼻咽癌的治療提供了新的選擇[9]。EBV作為導致鼻咽癌發(fā)病的重要病毒因素，其對患者免疫狀況的影響已被證實[10]。但是在鼻咽癌患者中有關EBV與外周血免疫細胞亞群間的關系研究較少，這種改變對患者預后的影響也尚不清楚。因此，本研究對NPC患者外周血EBV DNA載量與循環(huán)免疫細胞亞群的關系及其對預后的影響進行探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2016年1月—2019年10月四川省腫瘤醫(yī)院收治的203例初治無遠處轉移的鼻咽非角化型癌患者，從病歷中獲取臨床信息（包括性別、年齡、有無慢性病、有無吸煙飲酒史、診斷時間和治療數據）。納入及排除標準：（1）首次經病理明確診斷，并未行治療的NPC；（2）未見其他腫瘤疾?。唬?）無遠處轉移，即排除初治時則轉移的NPC（n=11）；（4）對常規(guī)放化療治療無禁忌；（5）未合并重癥感染者、精神疾病者；（6）無免疫系統疾病及既往未行免疫治療者。

1.2 治療方法

患者均接受了根治性放射治療，在腫瘤靶區(qū)、亞臨床靶區(qū)和淋巴引流區(qū)的中位總劑量分別為70～73 Gy、60～66 Gy和50～54 Gy。其中有111例患者接受了2～3周期誘導化療，然后接受同步放化療2～3周期。其余92例患者直接進行同步放化療。誘導化療為含鉑兩藥方案或三藥方案，順鉑+吉西他濱、順鉑+多西他賽或多西他賽+順鉑+氟尿嘧啶。其中多西他賽75 mg/m2，靜脈輸注d1；順鉑75 mg/m2，靜脈輸注d1～3；氟尿嘧啶500 mg/m2，靜脈輸注d1～5；每3周為1周期，誘導化療2～3周期。同步化療藥物為多西他賽+順鉑或單藥順鉑，其中順鉑 75 mg/m2，靜脈滴注d1～3，聯合或不聯合使用多西他賽75 mg/m2，靜脈輸注d1，每3周為1周期；或者單藥順鉑30 mg/m2，靜脈滴注，每周方案。

1.3 實驗方法

采集NPC患者治療前的肘靜脈血標本10 ml（EDTA抗凝）。通過實時熒光定量PCR法分析血漿EBV DNA。采用流式細胞儀分析治療前外周血循環(huán)免疫細胞亞群，測定免疫細胞亞群類型包括：CD3+T淋巴細胞、CD3+CD4+T淋巴細胞、CD3+CD8+T淋巴細胞、CD19+B淋巴細胞、CD56+NK細胞的比例及CD4+/CD8+的比值。

1.4 隨訪

末次隨訪時間為2020年10月，隨訪方式包括門診復查、住院復查和電話隨訪等。隨訪后有11例患者失訪；2例復發(fā)；10例發(fā)生轉移（治療后隨訪發(fā)生轉移者）；12例死亡，其中3例因其他疾病死亡。治療結束后2年內每3月隨訪1次,2～5年每6月復查1次,5年以后每年復查1次。復查內容包括血常規(guī)及生化、EBV DNA、鼻咽鏡及鼻咽MRI、胸片或低劑量胸部CT、腹部超聲和骨掃描。

1.5 統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（x±s）進行描述，組間比較采用t檢驗。采用MedCalc進行ROC分析，選取曲線下最大面積所對應的數值作為界值進行外周血淋巴細胞分組。采用Kaplan-Meier法統計總生存率（overall survival,OS）、無進展生存率（progression-free survival,PFS）、無局部復發(fā)生存率（local recurrence-free survival,LRFS）、無遠處轉移生存率（distant metastasis-free survival,DMFS）。采用Cox回歸模型進行多因素預后相關分析。采用Prism8.0軟件繪制統計圖。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般情況

203例（不包括失訪及因其他原因死亡的患者）初治非轉移性鼻咽非角化性癌患者，隨訪截至2020年10月。納入患者年齡18～79歲，中位年齡49歲。按照AJCC第8版鼻咽癌TNM分期進行分期。因非高發(fā)區(qū)可能會存在部分和EB病毒感染相關度不高的NPC患者，且不同實驗所使用的定量陽性標準模板也不同。根據實時熒光定量PCR法檢測結果，將患者分為兩組：EBV DNA≥400 copies/ml組（81例）和EBV DNA＜400 copies/ml組（122例），見表1。

表1 納入鼻咽癌患者一般資料Table 1 General data of included patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC)

2.2 免疫細胞亞群與臨床參數的相關性研究

分析結果表明，治療前血漿EBV DNA水平與CD19+B細胞比例呈負相關（r=-0.138,P=0.040），而與其他循環(huán)免疫亞群，包括CD3+T淋巴細胞、CD3+CD4+T淋巴細胞、CD3+CD8+T淋巴細胞、CD56+NK細胞的比例及CD4+/CD8+的比值，無明顯相關性（均P＞0.05）。NPC患者年齡與CD3+T細胞比例呈負相關（r=-0.177,P=0.012），與CD56+NK細胞比例呈正相關（r=0.216,P=0.002）?；颊咝詣e與CD4+/CD8+比值呈負相關（r=-0.139,P=0.049）。T分期與所有循環(huán)免疫亞群無明顯相關性（P＞0.05），而N分期與CD3+T細胞比例（r=0.164,P=0.02）和CD4+T細胞比例（r=0.14,P=0.046）呈正相關。外周血CD8+T細胞比例在不同性別、年齡、吸煙史、飲酒史、慢性病史、T分期、N分期、TNM分期中比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表2、圖1。

圖1 治療前鼻咽癌患者EBV DNA與外周血中免疫亞群測量的特征Figure 1 Characteristics of EBV DNA and immune subsets in peripheral blood of patients with nasopharyngeal carcinoma before treatment

表2 鼻咽癌患者外周血免疫細胞亞群比例在不同臨床特征中的比較 (x±s) Table 2 Comparison of peripheral blood immune cell subset proportion in NPC patients among different clinical features (x±s)

2.3 EBV DNA載量與生存關系

研究表明，EBV DNA＜400 copies/ml組和EBV DNA≥400 copies/ml組的3年OS、PFS、DMFS分別為99.2%vs.90.1%（P=0.001），96.7%vs.90.1%（P=0.028），98.4%vs.90.1%（P=0.005），兩組間差異均有統計學意義。EBV DNA＜400 copies/ml組和EBV DNA≥400 copies/ml組的3年LRFS分別為98.4%和100%，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2A～D。

圖2 Kaplan-Meier曲線顯示鼻咽癌患者EBV DNA不同分組的總生存率(A)、無進展生存率(B)、無轉移生存率(C)和無復發(fā)生存率(D)Figure 2 Kaplan-Meier curves of overall survival(A),progression-free survival(B),distant metastasis-free survival(C) and local recurrence-free survival(D) of NPC patients in different EBV DNA groups

2.4 EBV DNA載量的多因素分析

Cox比例風險模型進行多因素分析，其中引入以下參數來調整預后因素：性別（男性vs.女性），慢性病（有vs.無），吸煙史（有vs.無），飲酒史（有vs.無），年齡（≥50歲vs.＜50歲），T分期，N分期，治療前EBV DNA（≥400 copies/mlvs.＜400 copies/ml）。研究表明，EBV DNA載量（P=0.024）是NPC患者3年PFS的獨立預后影響因素，見表3。

表3 鼻咽癌患者臨床特征和EBV DNA的多變量分析Table 3 Multivariable analysis of clinical characteristics and EBV DNA in NPC patients

2.5 循環(huán)免疫細胞亞群預測NPC預后的ROC分析

經ROC分析，選取曲線下最大面積所對應的數值，NPC患者治療前CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD56+NK細胞比例以及CD4+/CD8+比值未找到合適的Cut-off值。而CD19+B細胞比例以8.33%作為界值預測OS、PFS、LRFS、MDFS的準確度最高。故根據CD19+B細胞比例將NPC患者分為CD19+B細胞低比例組83例（≤8.33%）和CD19+B細胞高比例組120例（＞8.33%），見圖3。

圖3 鼻咽癌患者治療前循環(huán)免疫細胞亞群的ROC曲線Figure 3 ROC curves of circulating immune cell subsets in NPC patients before treatment

2.6 CD19+B細胞的單因素分析

采用Log rank法單因素分析NPC患者治療前CD19+B細胞比例在預后中的價值。本研究表明，治療前NPC患者CD19+B細胞高比例組（＞8.33%）的3年OS為99.2%，CD19+B細胞低比例組（≤8.33%）的3年OS為90.4%（P=0.003），差異有統計學意義。CD19+B細胞高比例組3年時的PFS為97.5%，而低比例組的3年PFS為89.2%，差異有統計學意義（P=0.008）。治療前NPC患者CD19+B細胞低比例組與CD19+B細胞高比例組相比，3年DMFS（90.4%vs.98.3%,P=0.008）較低，差異有統計學意義。CD19+B細胞低比例組與CD19+B細胞高比例組的無復發(fā)生存率分別為98.8%和99.2%，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 Kaplan–Meier曲線顯示鼻咽癌患者CD19+B淋巴細胞不同分組的總生存(A)、無進展生存(B)、無轉移生存(C)、無復發(fā)生存(D) Figure 4 Kaplan-Meier curves of overall survival(A),progression-free survival(B),distant metastasis-free survival(C) and local recurrence-free survival(D) of NPC patients in different CD19+B lymphocytes groups

2.7 CD19+B細胞的多因素分析

Cox比例風險模型進行多因素分析。因CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD56+NK細胞比例以及CD4+/CD8+比值沒有找到合適的Cut-off值，單因素分析對預后無明顯意義，則未將這些免疫參數納入多因素分析。研究表明，CD19+B細胞比例是鼻咽癌患者3年PFS（P=0.007）、DMFS（P=0.014）的獨立預后影響因素，也是3年OS（P=0.008）的獨立預后因素，見表4。

表4 鼻咽癌患者臨床特征和CD19+B細胞的多變量分析Table 4 Multivariable analysis of clinical characteristics and CD19+B cell in NPC patients

3 討論

目前鼻咽癌主要的治療模式為同步放化療為主的綜合治療，但仍有部分患者發(fā)生復發(fā)和轉移。目前鼻咽癌預后的相關因素有：年齡，T、N、M分期和臨床分期，EBV DNA等，但仍不完善。尤其是對DMFS的預后，尚未找到很好的預測因素。找到可篩選出容易發(fā)生遠處轉移的高危鼻咽癌患者的分子生物學指標，是目前急需解決的難題之一。

現有研究已經證明EBV和NPC之間有很強的病因學聯系，循環(huán)血漿EBV DNA已被確定用于篩查、監(jiān)測和預測NPC疾病進展的可靠腫瘤標志物[3,11]。我們的研究結果表明，EBV DNA高的NPC患者PFS、OS以及DMFS均低于EBV DNA低的患者，而兩組之間LRFS無明顯差異。在多因素分析中，EBV DNA載量是NPC患者3年PFS的獨立預后影響因素。在一項Meta分析中也得出相似的結論：治療前EBV DNA水平可預測總體生存率、無進展生存率、無遠處轉移生存率和局部區(qū)域衰竭生存率[4]。王敏[12]研究發(fā)現EBV DNA水平能夠輔助進行臨床分型，并且能夠指導臨床進行預后的判斷；同時研究表明治療后出現遠處轉移者或復發(fā)者，EBV DNA水平較無遠處轉移、無復發(fā)者明顯升高。黎晚霞等[13]研究也表示治療前EBV DNA＞1500 copies/ml和≤1500 copies/ml兩組患者的生存預后具有顯著差異，治療前EBV DNA＞1500 copies/ml是NPC疾病進展的獨立危險因素。

從免疫的角度來看，部分鼻咽癌屬于EBV感染的惡性疾病，鼻咽癌也是一種免疫相關疾病[14]。病毒能夠感染刺激機體產生免疫效應，而腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)、轉移等生物學行為，均與免疫功能狀態(tài)有關[15]。但有關鼻咽癌患者中血漿EBV DNA與循環(huán)免疫細胞亞群之間的相關性，以及其對預后研究較少。本研究結果顯示，EBV DNA與CD19+B細胞比例呈負相關（r=-0.138,P=0.040），而與其他循環(huán)免疫細胞亞群，包括CD3+T淋巴細胞、CD3+CD4+T淋巴細胞、CD3+CD8+T淋巴細胞、CD56+NK細胞的比例及CD4+/CD8+的比值，無明顯相關性（P＞0.05）。Xu等[16]研究結果也表示EB病毒載量與CD19+B細胞比例呈負相關，但其研究也表示EB病毒載量與CD4+/CD8+比值呈負相關，與其他循環(huán)細胞免疫亞群無明顯相關性。B細胞是病毒感染的主要靶標，CD19是一種分子量為95000的糖蛋白，為最早發(fā)現的B淋巴細胞系表面標志[16-17]。EB病毒載量引起CD19+B細胞比例改變在其他疾病中也有相應的研究證據。Fedyanina等[18]研究表示與沒有原發(fā)性EBV感染的傳染性單核細胞增多癥（IM）患者相比，由原發(fā)性EBV感染引起的經典IM兒童的CD19+細胞的比例較低。本研究同時表示NPC患者CD19+B細胞高比例組的OS、PFS以及DMFS均高于CD19+B細胞低比例組，兩組之間LRFS也無明顯差異。雖然其他循環(huán)免疫細胞亞群與EBV DNA無相關性，但是在本研究中發(fā)現某些循環(huán)免疫細胞亞群與其他臨床參數有一定的相關性。NPC患者年齡與CD3+T細胞比例呈負相關，與CD56+NK細胞比例呈正相關。T分期與所有循環(huán)免疫亞群無明顯相關性，而N分期與CD3+T細胞比例和CD4+T細胞比例呈正相關。正如努熱古·阿熱甫等[8]研究發(fā)現局部晚期NPC患者不同年齡階段，CD3+T細胞比例和NK細胞比例存在差異,而不同N分期之間CD3+T細胞比例也不同。

本研究仍具有局限性。首先，該研究所收集數據具有一定局限性，未能收集全所有患者治療后EBV DNA數據，也未能收集全所有患者循環(huán)細胞免疫亞群的動態(tài)變化，所以未進行治療后的分析。其次，本研究屬于回顧性分析，樣本量偏小，存在選擇偏倚，可能對結果造成一定影響。未來需要大樣本、多中心、前瞻性臨床研究進行驗證來支持目前的發(fā)現。

本研究發(fā)現，治療前通過抽取NPC患者少量的外周血進行流式分析以及實時熒光定量PCR法，獲取外周血淋巴細胞亞群的比例以及EBV DNA拷貝數，可以對NPC的預后有一定預測價值，尤其是對DMFS有一定的預測價值。治療前血漿EBV DNA與外周血中CD19+B細胞比例存在負相關，兩者可作為鼻咽癌患者的預后預測指標。我們或許能以此作為標準對高危遠處轉移患者進行初步篩選，并針對性地給予個體化的治療，從而最大限度地消除腫瘤，并對這些高危患者進行更密切的隨訪觀察。病毒感染影響免疫功能，而免疫功能不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，同時也與患者的預后顯著相關[5,19]。我們也可以進一步的對各種循環(huán)免疫亞群細胞表面的分子標記進行分析，從而進一步揭示免疫機制在NPC發(fā)生發(fā)展中的影響，為今后的免疫治療在NPC的開展提供依據。