蔡衛(wèi)，陳宏璘，張建永，楊遠(yuǎn)維，王潔，彭康

0 引言

膠質(zhì)瘤（glioma）是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，目前的治療手段包括手術(shù)、放療、化療、免疫治療等，但平均生存期仍只有10～12月[1-2]。膠質(zhì)瘤極強(qiáng)的侵襲性是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率高的主要原因之一[3]。替莫唑胺（temozolomide,TMZ）是目前膠質(zhì)瘤術(shù)后化療的一線藥物，臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明其可以延長膠質(zhì)瘤患者的生存期，但是因?yàn)榛瘜W(xué)耐藥的存在，使其在膠質(zhì)瘤的臨床應(yīng)用上進(jìn)展不盡人意[4-5]。所以如何提高TMZ對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用成為我們關(guān)注的重點(diǎn)。E-cadherin已經(jīng)在多種腫瘤中展現(xiàn)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[6-7]。其表達(dá)降低或缺失將破壞細(xì)胞間的連接，使腫瘤細(xì)胞間的黏附作用減弱，脫離原發(fā)病灶，從而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[8-9]。

白花丹醌（plumbagin,PL）是白花丹的主要活性成分[10]。白花丹醌作為一種民族藥材，用藥歷史悠久，常用治跌打損傷等[11]。越來越多的證據(jù)表明，其在多種腫瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)出抑制腫瘤生長的作用，尤其是抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的能力[12-13]。為此本研究對白花丹醌聯(lián)合替莫唑胺對人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的遷移和侵襲作用及其機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

U251細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；鼠抗E-cadherin單克隆抗體購自美國Abcam公司；白花丹醌購自中國上海純優(yōu)生物科技有限公司；Temozolomide（NSC 362856）購自美國MCE公司。鼠抗β-actin單克隆抗體購自中國Chemicon公司；CCK-8試劑盒購自中國碧云天生物公司；DMSO二甲基亞砜采購自上海生工（進(jìn)口分裝）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基采購自美國Gibco公司；基質(zhì)膠購自美國Corning Biocoat（貨號356234）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞用含10%的小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞呈貼壁生長，待細(xì)胞長滿瓶底后，棄掉培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化,2～3天分瓶傳代培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖 按照說明書，常規(guī)消化細(xì)胞，分組制備單細(xì)胞懸液，平行接種于96孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)基總量100 μl，設(shè)3個平行孔，貼壁后實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度藥物（PL、TMZ、PL+TMZ），對照組加入相應(yīng)DMSO，混合均勻；37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔中加入10 μl CCK8液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h；酶標(biāo)儀檢測各孔OD值。

1.2.3 細(xì)胞劃痕法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力 取對數(shù)期U251細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞在六孔板內(nèi)培養(yǎng)至基本融合，用200 μl微量移液槍頭垂直劃痕，PBS液沖洗3次后加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，按照分組加入DMSO、PL、TMZ和PL+TMZ，混合均勻，顯微鏡下觀察48 h細(xì)胞體外遷移能力。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力 取對數(shù)期U251細(xì)胞鋪板，長滿后用胰酶消化細(xì)胞，終止消化后，用含1%BSA的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×105個/毫升，實(shí)驗(yàn)組和對照組分別加上PL、TMZ、PL+TMZ聯(lián)合用藥和DMSO混勻處理。冰上操作用無血清DMEM培養(yǎng)基2∶1稀釋Matrigel，濃度為50 μg/ml，Transwell小室微孔膜上表面鋪滿Matrigel稀釋液（每孔50 μl），然后將小室靜置于37℃環(huán)境下，使Matrigel聚合成凝膠；取200 μl細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室，輕輕搖晃使之均勻鋪開，下室加入含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基500 μl，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出上室用棉簽輕擦去膜上方的細(xì)胞，多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS漂洗兩次。每個上室隨機(jī)取5個100倍視野拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡檢測蛋白表達(dá)變化 應(yīng)用0.1%DMSO,1.25 μmol/L PL,200 μmol/L TMZ,1.25 μmol/L PL+200 μmol/L TMZ處理細(xì)胞48 h，用裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，收集蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)過轉(zhuǎn)膜等操作后，用軟件處理不同的條帶，測量目標(biāo)蛋白的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0軟件處理數(shù)據(jù)，兩樣本間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組樣本間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白花丹醌可以增強(qiáng)替莫唑胺抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖能力

CCK-8結(jié)果顯示分別應(yīng)用0.1%DMSO、10 μmol/L TMZ、50 μmol/L TMZ、100 μmol/L TMZ、200 μmol/L TMZ和400 μmol/L TMZ處理U251細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活率下降，增殖抑制率分別為（0.87±0.18）%、（3.5±1.28）%、（5.69±2.39）%、（21.6±4.32）%、（60.7±2.58）%和（67.23±3.98）%；從中我們可以發(fā)現(xiàn)替莫唑胺濃度超過200 μmol/L后，再升高其濃度，U251細(xì)胞抑制率升高不明顯，故聯(lián)合用藥選擇濃度 200 μmol/L。分別應(yīng)用0.1%DMSO、1.25 μmol/L PL、2.5 μmol/L PL、5 μmol/L PL、10 μmol/L PL和 20 μmol/L PL處理U251細(xì)胞48 h，細(xì)胞增殖抑制率為（0.79±0.22）%、（21.6±1.82）%、（27.1±1.54）%、（43.75±4.71）%、（61.08±3.28）%和（96.23±4.53）%。1.25 μmol/L為設(shè)置濃度梯度中最小值，故聯(lián)合用藥中百花丹醌選用此濃度。聯(lián)合用藥處理48 h后，U251細(xì)胞增殖抑制率為（75.69±2.35）%，明顯高于單獨(dú)應(yīng)用白花丹醌（P=0.012）或替莫唑胺組（P=0.034），見圖1。

圖1 CCK-8檢測PL(A)、TMZ(B)和PL+TMZ(C)處理后U251細(xì)胞增殖抑制率Figure 1 Proliferation inhibition rate of U251 cells treated with PL(A),TMZ(B) and PL+TMZ(C) detected by CCK-8

2.2 白花丹醌聯(lián)合替莫唑胺對U251細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1.25 μmol/L 白花丹醌聯(lián)合替莫唑胺可以明顯增強(qiáng)替莫唑胺抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的能力（P=0.023），見圖2。

圖2 不同藥物處理后U251細(xì)胞遷移能力的變化Figure 2 Migration abilities of U251 cells treated with different drugs

2.3 白花丹醌聯(lián)合替莫唑胺對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥后U251細(xì)胞的侵襲能力明顯降低（P＜0.05），見圖3。

2.4 聯(lián)合用藥后U251細(xì)胞E-cadherin蛋白的表達(dá)變化

Western blot結(jié)果顯示，和聯(lián)合用藥相比，DMSO對照組、TMZ組、PL組E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯減少（均P＜0.05），見圖4。

圖4 不同藥物處理后U251細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)情況Figure 4 Expression of E-cadherin in U251 cells after different drug treatments

3 討論

由于膠質(zhì)瘤單純手術(shù)治療效果不佳，自20世紀(jì)80年底以來，化療成為腦膠質(zhì)瘤重要的輔助治療手段，而TMZ作為一線化療藥物易產(chǎn)生耐藥[14]。提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺的敏感度成為人們關(guān)注的重點(diǎn)。部分研究表明一些化合物及化學(xué)藥物可以增加替莫唑胺的耐藥性，崔勇等[15]研究發(fā)現(xiàn)RNA干擾AKT2的表達(dá)可以提高膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤替莫唑胺的敏感度；張春麗等[16]研究發(fā)現(xiàn)七氟醚可以降低人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞替莫唑胺抵抗，從而提高替莫唑胺對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷能力；王新等[17]研究發(fā)現(xiàn)替莫唑胺聯(lián)合放射治療誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞自噬，從而增加替莫唑胺對膠質(zhì)瘤的殺傷作用；還有研究表明地昔帕明[18]、二甲雙胍[19]可以提高替莫唑胺對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用。本研究通過CCK-8法證明白花丹根莖中提取的中藥單體白花丹醌可以提高替莫唑胺對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明小劑量的白花丹醌可以提高替莫唑胺抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明聯(lián)合用藥后U251細(xì)胞E-cadherin蛋白的表達(dá)升高。E-cadherin屬于鈣黏素家族成員，有研究表明其和多種腫瘤的惡性行為相關(guān)。E-cadherin的升高表明腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力下降[20]，從而降低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。有研究表明TMZ的耐藥機(jī)制還包括以下幾個方面：（1）DNA損傷修復(fù)。目前認(rèn)為，TMZ耐藥是O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methyl-guanine-DNA-methytransferase,MGMT）、錯配修復(fù)（mismatch repair,MMR）、堿基切除修復(fù)（base excision repair,BER）等DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)以及自噬、腫瘤干細(xì)胞等共同作用的結(jié)果；（2）腫瘤細(xì)胞的自噬。目前大量研究證實(shí)，自噬可能是腫瘤細(xì)胞面對治療壓力時的促生存反應(yīng)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的密集增殖以幫助腫瘤細(xì)胞抵御多種不利的環(huán)境因素（如化療藥物、放射線等），從而使腫瘤細(xì)胞在某些治療中存活；（3）對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（GSCs）與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）耐藥性的關(guān)系，學(xué)界普遍認(rèn)為GSCs的存在使GBM細(xì)胞對TMZ等藥物治療產(chǎn)生了耐藥性，從而導(dǎo)致治療效果不佳[4]。關(guān)于聯(lián)合用藥作用是否可以通過其他機(jī)制作用，將成為我們以后研究的重點(diǎn)。