宋相偉 , 竇馨月, 沙 悅, 羅 銳, 王雪麗

(1.長(zhǎng)春師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春130032； 2.吉林工商學(xué)院 糧食學(xué)院, 長(zhǎng)春130507)

Exendin-4是由一種希拉毒蜥唾液腺分泌的39肽[1], 與人體內(nèi)胰高血糖素家族具有高度同源性. Exendin-4與胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1 R)結(jié)合可發(fā)揮獨(dú)特的降血糖作用[2-3], 目前已被美國(guó)禮來公司開發(fā)成為Ⅱ型糖尿病治療藥物——艾塞那肽[4-5]. 文獻(xiàn)[6-8]研究表明, Exendin-4在治療神經(jīng)退行性疾病及新生兒神經(jīng)系統(tǒng)障礙疾病等方面作用顯著.

Exendin-4結(jié)構(gòu)由三部分組成： N端的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu), 中心區(qū)域的α-螺旋結(jié)構(gòu)以及C端的Trp-Cage結(jié)構(gòu). 其中N端無規(guī)則卷曲主要負(fù)責(zé)激活受體[9]；α-螺旋結(jié)構(gòu)主要負(fù)責(zé)與GLP-1受體結(jié)合, 分為N端螺旋(9～15位氨基酸)和C端螺旋(19～27位氨基酸)兩部分, 負(fù)責(zé)與GLP-1受體胞外區(qū)N端相互作用, 是與受體相互作用的主要區(qū)域, 占總結(jié)合力的79%, 第22位的Phe參與激活受體[10]； Trp-cage結(jié)構(gòu)可穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu), 幾乎不參與激活受體.

Exendin-4的水溶性差、 易聚集等特性限制了其更好地發(fā)揮生物活性作用. 本文以去除和替換的方式對(duì)Exendin-4的N端和C端α-螺旋進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造, 設(shè)計(jì)了結(jié)構(gòu)類似物ExA，ExB，ExC，ExD, 以進(jìn)一步研究 Exendin-4螺旋結(jié)構(gòu)與其生物活性和穩(wěn)定性的關(guān)系, 為設(shè)計(jì)篩選高活性Exendin-4結(jié)構(gòu)模擬物提供結(jié)構(gòu)信息, 最終為糖尿病和神經(jīng)退行性疾病藥物的開發(fā)提供先導(dǎo)化合物.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

胰島β細(xì)胞系RINm-5F(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫， 編號(hào)： CCTL-11605)； 培養(yǎng)基RPMI-1640(美國(guó)GIBCO公司)； 小牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)； 四甲基偶氮唑鹽(MTT, 美國(guó)Sigma公司)； 二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ, 美國(guó)Sigma公司). 圓二色譜儀(Jasco J-810型, 日本島津公司)； 熒光光譜儀(RF-5301PC型, 日本島津公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 Exendin-4及類似物的合成

Exendin-4及類似物由上海吉爾生化有限公司合成.

1.2.2 圓二色譜檢測(cè)

圓二色(CD)波長(zhǎng)范圍185～270 nm， 速度20 nm/min， 狹縫寬度 2 nm， 4次掃描， 響應(yīng)時(shí)間4 s， 溫度25 ℃; Exendin-4及模擬物用磷酸鹽(PBS)緩沖液配制成50 μmol/L溶液； 數(shù)據(jù)處理用Origin 9.0軟件(美國(guó)OriginLab公司)繪制波長(zhǎng)毫度曲線.

1.2.3 熒光光譜分析

激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為297 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)掃描模式范圍設(shè)為300～510 nm, 狹縫寬為5 nm； 樣品制備方法與圓二色譜樣品制備方法相同； 數(shù)據(jù)處理用Origin 9.0軟件繪制熒光譜.

1.2.4 生物活性檢測(cè)

以2×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度將胰島β細(xì)胞RINm-5F接種于96孔板上； 37 ℃,φ(CO2)=5% 培養(yǎng)12 h后加入Exendin-4及結(jié)構(gòu)模擬物, 繼續(xù)培養(yǎng)48 h； 加入10 μL MTT(5 mg/mL)于37 ℃孵育4 h； 吸出上清液后加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL/孔完全溶解結(jié)晶； 利用酶標(biāo)儀在490 nm/630 nm波長(zhǎng)下檢測(cè).

1.2.5 穩(wěn)定性檢測(cè)

用pH=8.0 Tris-HCl將Exendin-4 及模擬物配制為25 μmol/L, 分別向模擬物中加入適量的DPPⅣ酶, 37 ℃孵育48 h后取樣, 用等體積的體積分?jǐn)?shù)為10%的三氟乙酸(TFA)終止反應(yīng).

樣品經(jīng)1 mL C18固相萃取柱預(yù)處理后， 用C8柱反相高效液相進(jìn)行分析, 檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm. 根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的峰面積計(jì)算剩余Exendin-4以及模擬物的百分?jǐn)?shù).

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

用Origin 9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析. 生物活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)表示, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, 顯著性差異用P值表示, 其中*P< 0.05, **P<0.01, ***P<0.001被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； ns為無顯著差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 模擬物設(shè)計(jì)

為研究N端螺旋與生物活性及穩(wěn)定性關(guān)系, 設(shè)計(jì)模擬物ExA和ExB： 將Exendin-4 的N端螺旋(9～15位氨基酸)去除即為ExA； 將Exendin-4 的N端螺旋(9～15位氨基酸)用3個(gè)連續(xù)的Ala替換即為ExB. 為研究C端螺旋與生物活性及穩(wěn)定性關(guān)系, 設(shè)計(jì)模擬物ExC和ExD： 用3個(gè)連續(xù)的Ala替換Exendin-4的C端螺旋(19～27位氨基酸)即為ExC； 在ExC基礎(chǔ)上將第13位Gln替換為Tyr即為ExD. Exendin-4模擬物序列列于表1.

表1 Exendni-4模擬物序列

2.2 圓二色譜檢測(cè)結(jié)果

利用圓二色譜分析模擬物α-螺旋結(jié)構(gòu)的變化， 結(jié)果如圖1所示. 由圖1(A)可見， Exendin-4、 ExA和ExB在191 nm處均有正峰, 在221～222 nm和207～210 nm處有2個(gè)負(fù)峰, 是標(biāo)準(zhǔn)α-螺旋CD圖譜. 螺旋的百分?jǐn)?shù)及穩(wěn)定性列于表2. 由表2可見， 由于N端螺旋的缺失, 導(dǎo)致ExA的峰值最低, 在4個(gè)模擬物中螺旋百分?jǐn)?shù)最低(32.9%), 與預(yù)期設(shè)計(jì)結(jié)果相符； 由于ExB 用多聚Ala形成的螺旋替代了原有N端螺旋, 因此α-螺旋的百分?jǐn)?shù)沒有降低(82.4%), 甚至高于Exendin-4螺旋的百分?jǐn)?shù).

圖1 Exendin-4模擬物的圓二光譜Fig.1 Circular dichroism spectra of Exendin-4 mimetics

表2 α-螺旋的百分?jǐn)?shù)及穩(wěn)定性

結(jié)構(gòu)模擬物ExB與ExA相比, 因可形成螺旋結(jié)構(gòu)的3個(gè)Ala彌補(bǔ)了原有N端螺旋的缺失,α-螺旋的百分?jǐn)?shù)仍可保持原有水平, 通過促胰島細(xì)胞增殖生物活性檢測(cè)可知, 其生物學(xué)活性仍保持原有水平, 甚至在高濃度下具有更顯著的促胰島細(xì)胞增殖活性. 因此, 結(jié)合ExA與ExB的CD圖譜以及促胰島細(xì)胞增殖活性數(shù)據(jù)可以推斷, 保持N端α-螺旋結(jié)構(gòu)是維系其生物活性的必要條件, 但N端螺旋序列并未呈現(xiàn)特異性要求.

由圖1(B)可見， ExC和ExD均存在α-螺旋結(jié)構(gòu), 螺旋的百分?jǐn)?shù)與Exendin-4相當(dāng), 表明C端螺旋可通過易形成螺旋的3個(gè)Ala進(jìn)行替換, 以維系Exendin-4原有結(jié)構(gòu)構(gòu)象； 另一方面, 因在ExD中的13位將Gln替換為Tyr, 導(dǎo)致ExD的峰值高于ExC, 即ExD螺旋略高于ExC螺旋的百分?jǐn)?shù), 表明Tyr13有助于螺旋的形成. 文獻(xiàn)[9]研究表明， 在GLP-1的 N端序列中, 第1位His、 第6位Phe和第13位Tyr形成的穩(wěn)定疏水簇可與GLP-1受體疏水性口袋相互作用, 其中位于α-螺旋表面的Tyr13是與受體相互作用的接觸點(diǎn)之一, Tyr13可視為結(jié)合和激活受體的關(guān)鍵氨基酸. ExD和ExC的CD結(jié)果進(jìn)一步證明, 將第13位替換為胰高血糖素家族中保守的Tyr13時(shí)更有利于形成α-螺旋結(jié)構(gòu), 是優(yōu)化Exendin-4的重要位點(diǎn).

2.3 熒光光譜分析結(jié)果

在 Exendin-4的C端(31～39位氨基酸)存在一個(gè)以第25位氨基酸Trp為中心的籠狀疏水簇, 稱為Trp-cage結(jié)構(gòu). 因此, 利用Trp熒光光譜變化可監(jiān)測(cè)Trp-cage的結(jié)構(gòu)變化. Exendin-4模擬物的熒光光譜如圖2所示. 由圖2(A)可見： ExA的峰位在353 nm處, 與Exendin-4峰位350 nm相比發(fā)生了3 nm紅移, 表明Trp-cage結(jié)構(gòu)中心的Trp更趨向暴露于親水環(huán)境, Trp-cage結(jié)構(gòu)趨于疏松, 表明去除N端螺旋影響了C端Trp-cage結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性； ExB與Exendin-4的峰位相同, 仍在350 nm處, 表明Trp-cage結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變. 因此3 個(gè)Ala形成的螺旋結(jié)構(gòu)代替原N端螺旋后, 未對(duì)Exendin-4末端Trp-cage結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響. 由圖2(B)可見： ExC的峰位在352 nm處, 與Exendin-4峰位350 nm相比發(fā)生了2 nm紅移, 表明Trp-cage結(jié)構(gòu)變疏松, 趨于親水, 因此C端螺旋結(jié)構(gòu)更接近Trp-cage結(jié)構(gòu), 由于對(duì)螺旋中氨基酸的種類和順序有一定要求, 因此比N端螺旋更易影響Trp-cage結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定狀態(tài)； 另一方面, 由于將第13位Gln替換為Tyr, 使ExD的熒光光譜相對(duì)于ExC熒光光譜發(fā)生了24 nm藍(lán)移； 此外, ExD相對(duì)于Exendin-4的峰位發(fā)生了22 nm的顯著藍(lán)移， 表明引入Tyr有助于Trp-cage結(jié)構(gòu)更緊湊, 進(jìn)一步證明了Tyr13對(duì)于維系Trp-cage的緊湊結(jié)構(gòu)具有重要作用.

圖2 Exendin-4模擬物的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of Exendin-4 mimetics

2.4 生物活性檢測(cè)結(jié)果

Exendin-4具有刺激胰島β-細(xì)胞增殖及抑制胰島β-細(xì)胞凋亡的生物活性. 利用MTT法檢測(cè)Exendin-4及模擬物對(duì)胰島細(xì)胞數(shù)量的影響, 結(jié)果如圖3所示. 由圖3可見， 4種Exendin-4結(jié)構(gòu)模擬物均具有促RINm-5F細(xì)胞增殖的活性, 其中ExC與ExD在40～200 μmol/L濃度內(nèi)的活性顯著高于原始肽Exendin-4.

圖 3 Exendin-4模擬物體外細(xì)胞活性檢測(cè)Fig.3 Bioactivity test of cell of Exendin-4 mimetics in vitro

在胰高血糖素家族中, 氨基酸序列具有較高同源性, N端His1,Phe6和N端螺旋上的Tyr13均為保守氨基酸位點(diǎn), 它們可形成一個(gè)疏水簇, 是激活受體的主要結(jié)構(gòu). 與胰高血糖素家族相比, Exendin-4的N端第1位和第6位同樣具有保守氨基酸His,Phe, 模擬物ExA與Exendin-4同樣具有保守氨基酸His1和Phe6, 由于缺少N端螺旋部, 影響了與N端無規(guī)則卷曲部分保守氨基酸形成激活GLP-1受體的疏水簇, 因此ExA生物活性降低. 當(dāng)Exendin-4的N端螺旋用3個(gè)Ala替代時(shí)(ExB), 仍能保持螺旋構(gòu)象, 但此時(shí)N端螺旋的序列中缺少與N端無規(guī)則卷曲部分相互作用的氨基酸, 激活受體的疏水簇不能有效形成, 使其活性小于Exendin-4活性. 因此, N端螺旋是否存在以及螺旋的一級(jí)結(jié)構(gòu)信息與Exendin-4的生物活性有直接關(guān)系.

當(dāng)保留N端螺旋序列, 用3個(gè)Ala替代C端序列(ExC)時(shí), N端螺旋與N端無規(guī)則卷曲區(qū)域仍能有效形成疏水簇激活受體, 因此活性未下降. 在ExC和ExD中, 由3個(gè)Ala形成螺旋結(jié)構(gòu)的柔韌性可能優(yōu)于原螺旋序列, C端螺旋結(jié)構(gòu)的優(yōu)化可能使整個(gè)結(jié)構(gòu)與GLP-1R結(jié)合自由度發(fā)生了改變, 空間定位的變化使配體可更有效地激活受體. ExD中引入Tyr13促使螺旋含量和促胰島細(xì)胞增殖活性顯著上升, 推測(cè)增殖活性的升高可能與Tyr13能夠和N端His1，Phe6更好地形成疏水簇激活受體有關(guān).

2.5 穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

DPPⅣ酶是一種生物體內(nèi)常見的酶, 其主要作用是分解體內(nèi)蛋白質(zhì), 利用DPPⅣ酶進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)可部分反映多肽模擬物在體內(nèi)的穩(wěn)定性. 由表2可見, 針對(duì)N端螺旋設(shè)計(jì)的模擬物ExA和ExB, 穩(wěn)定性ExB>ExA, 穩(wěn)定性與螺旋的百分?jǐn)?shù)存在一定的正相關(guān)性； 針對(duì)C端螺旋設(shè)計(jì)的模擬物ExC和ExD, 在ExC的基礎(chǔ)上引入了胰高血糖素家族中在第13位高度保守的Tyr, 使螺旋的百分?jǐn)?shù)小幅度增加, 穩(wěn)定性大幅度提高(22%), 即ExD>ExC, 穩(wěn)定性與螺旋的百分?jǐn)?shù)也存在正相關(guān)性.

為進(jìn)一步了解N和C端螺旋與穩(wěn)定性的關(guān)系, 對(duì)ExB和ExC螺旋的百分?jǐn)?shù)和穩(wěn)定性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, ExB和ExC分別用3個(gè)Ala的螺旋替換原N和C端螺旋, 螺旋的百分?jǐn)?shù)基本相同, 但穩(wěn)定性差別較大, ExB比ExC穩(wěn)定性高51%, 可見C端螺旋被替換后對(duì)穩(wěn)定性影響較大, 表明C端螺旋序列比N端螺旋序列對(duì)于Exendin-4的穩(wěn)定性影響更大.

綜上所述, 由于N端螺旋參與激活受體疏水簇的形成, 因此N端的變化極易削弱Exendin-4的生物活性； C端螺旋氨基酸序列信息的特異性對(duì)Exendin-4 在DPPⅣ酶環(huán)境的穩(wěn)定性影響大于N端螺旋序列； 將13位的Gln替換為胰高血糖素家族保守的Tyr有利于提高螺旋的百分?jǐn)?shù), 促進(jìn)與N端無規(guī)則卷曲區(qū)域形成疏水簇增強(qiáng)激活受體的能力, 是Exendin-4序列可進(jìn)行優(yōu)化的重要位點(diǎn).