胡佳慧， 王海丞， 黃 潔， 周笑天， 王佐林

（上海牙組織修復與再生工程技術研究中心，同濟大學口腔醫(yī)學院，同濟大學附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，上海 200072）

種植體的存留率與種植體周軟硬組織的狀態(tài)密切相關，良好的三維植入位置有利于種植體周軟硬組織保持長期穩(wěn)定。種植體的三維位置包括種植體的唇（頰）舌向[1]、冠根向、近遠中向[2]。對于連續(xù)植入的種植體，相鄰2個種植體間的間距是需要慎重考慮的。Grunder等[3]提出，當相鄰的種植體間距≥3 mm時，種植體間的骨高度與種植體平臺水平能保持一致，間距＜3 mm時，則會發(fā)生骨吸收，繼而造成種植體間齦乳頭退縮。Tarnow等[4]的研究指出，種植體與基臺連接后，由于生物學寬度的建立會產(chǎn)生1.3～1.4 mm的水平性骨吸收，種植體間距過小時會發(fā)生水平性骨吸收的重疊，進一步引起嵴頂骨高度的下降。

2018年牙周共識會議[5]將種植體周炎定義為以菌斑為始動因素的種植體周黏膜炎癥伴持續(xù)進展的種植體周骨組織喪失。菌斑生物膜是公認的種植體周炎的始動因素[6]。菌斑的積累會造成種植體周圍組織的感染,出現(xiàn)局部炎癥現(xiàn)象。臨床對種植體周炎的診斷主要通過臨床評價指標和影像學結果來綜合評判。目前，種植體周炎的最新臨床診斷標準為種植體周軟組織有紅腫熱痛、溢膿等炎癥表現(xiàn)，探診出血（BOP），探診深度（PD）較基線值增加或PD≥6 mm及影像學檢查顯示有骨喪失或骨喪失較基線值≥2 mm[7]。

本實驗按照不同種植體間距在比格犬下頜骨上連續(xù)植入種植體，通過觀察種植體周軟硬組織的變化，驗證不同種植體間距與種植體周炎的相關性，為臨床工作提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、材料和設備

1.1.1 實驗動物12月齡健康成年雄性比格犬6只（上海甲干生物科技有限公司，中國），體質(zhì)量約為12 kg。

1.1.2 實驗材料種植體（Straumann公司,瑞士）；舒泰50（25 mg/mL唑拉西泮+25 mg/mL替來他明，Virbac公司,法國）；陸眠寧Ⅱ（主要成分為鹽酸賽拉嗪，其他成分包括乙二胺四乙酸、鹽酸二氫埃托啡和氟哌啶醇，華牧公司，中國）；Willanms O型牙周探針（康橋公司，中國）；阿替卡因腎上腺素注射液、4%多聚甲醛溶液（上?？缮锟萍加邢薰?，中國）；0.9%氯化鈉溶液、青霉素G鈉（上海國藥集團化學試劑有限公司，中國）；樹脂包埋劑（Kulzer公司，德國）；Van Gieson（VG）染色液（Solarbio公司,美國）。

1.1.3 實驗設備和軟件 錐形束CT（CBCT；J.Morita公司，日本）；導板設計軟件、光學掃描儀（3Shape Dental System公司，丹麥）；X線片機（Dentsply Rinn公司，瑞士）；硬組織切片機（Exakt300CP公司，德國）；硬組織磨片機（Exakt400CS公司，德國）；體視顯微鏡、照相系統(tǒng)（Nikon公司,日本）。

1.2 方法

1.2.1 犬下頜牙的拔除與數(shù)字化導板的設計肌內(nèi)注射舒泰50（0.08 mL/kg）和陸眠寧Ⅱ（0.01 mL/kg），對6只比格犬行全身麻醉后，拔除其雙側(cè)下頜第二前磨牙至第一磨牙，復位，縫合（圖1A、1B）。 拔牙后6周拍攝CBCT，同時精確制取犬上下頜石膏模型，并用光學掃描儀掃描獲取口腔內(nèi)軟硬組織信息，在導板設計軟件中對種植體的三維位置進行設計，最終完成并3D打印手術導板（圖1C、1D）。每一側(cè)連續(xù)植入4枚種植體，并設置3個分組，分別為1、2、3 mm的種植體間距。種植體間距定義為2枚植體平臺外側(cè)緣水平連線的距離。間距位置采用隨機交叉分組設計。

1.2.2 種植手術過程拔牙8周后，提前對比格犬禁水、禁食12 h以上，麻醉方法同1.2.1。數(shù)字化外科導板引導下進行種植窩的預備。每側(cè)平行植入連續(xù)的4枚大顆粒噴砂酸蝕 （sandblasted,large-grit and acid-etched,SLA）表面處理種植體（3.3 mm×8.0 mm），初期穩(wěn)定性均在30～35 N·cm。修整牙槽嵴頂，使種植體平臺與牙槽嵴頂保持水平，所有種植體均為非潛入式愈合，選擇不同高度的愈合帽確保穿齦高度位于齦上1 mm，并避免與對頜牙的咬合接觸。用3-0編織縫合線縫合創(chuàng)口。詳見圖1E～1I。術后連續(xù)7 d肌內(nèi)注射青霉素G鈉（80萬U/d），給予軟食。術后2周拆線。

圖1 比格犬種植模型構建流程Figure 1 Procedures of constructing implantation model in beagle dogs

1.2.3 臨床牙周指標的記錄術后2周末為觀察基線點，此時種植區(qū)域軟組織的術后反應消退，黏膜無紅腫，傷口達到一期愈合。測量并對比術后2周、3個月時的種植體周臨床牙周指數(shù)，包括菌斑指數(shù)（PI）、探診深度（PD）、探診出血（BOP）陽性率。檢測位點如圖2A、2B所示。其中，PI分級標準為無菌斑（0分）；菌斑肉眼不可見，用探針尖的側(cè)面可刮出菌斑（1分）；菌斑明顯可見（2分）；大量菌斑積聚（3分）。PD是指種植體周的齦溝深度，即齦溝底到牙齦頂點的距離。當種植體周圍組織健康時，通常認為生理性種植體周PD不應超過3 mm，一般PD≥5 mm表明種植體周圍組織可能出現(xiàn)炎癥。BOP分為陽性和陰性，具體操作方法為將牙周探針輕探入齦溝或牙周袋內(nèi)，取出探針，10～15 s后觀察有無牙齦出血，有出血為陽性，無出血為陰性，注意探診壓力不應超過0.25 N。將術后3個月時的PD按照<3 mm、3～5 mm、≥5 mm進行分級，并統(tǒng)計位點頻數(shù)，同時對術后3個月時各分組中出現(xiàn)PD≥5 mm、BOP陽性及PI≥2的檢測位點頻數(shù)進行統(tǒng)計和比較。

1.2.4 菌斑的采集和分析術后3個月時進行齦周菌斑的采集，以愈合帽頰舌向作為中軸，每間距組取愈合帽靠近間距側(cè)周圍的菌斑記為1個位點。用干棉球擦拭牙面，隔濕，用金屬牙齦刮治器小心刮取愈合帽對應區(qū)域的菌斑，取出后立即置入含150 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的無菌凍存管內(nèi)。將樣本標記后于干冰上保存，并于48 h內(nèi)進行16S rRNA基因測序分析。經(jīng)過微生物組總DNA提取、聚合酶鏈反應（PCR）擴增、文庫構建、上機測序和數(shù)據(jù)分析的一系列過程，最終得到不同分類水平的菌群豐度分析結果，對菌屬水平的結果進行分析并篩選出排名前100的具有組間表達差異且與牙周炎癥發(fā)展密切相關的菌屬。

1.2.5 影像學觀察和測量于種植術后1、2、3個月時采用X線片平行投照技術對術區(qū)進行影像學成像，并使用Image J軟件對數(shù)字化圖像進行測量。種植體間的骨吸收分為2個部分測量，分別為邊緣骨吸收（marginal bone resorption，MBR）與嵴頂骨吸收（crestal bone resorption，CBR）。記錄每個時間點各個位點的MBR和CBR，同時統(tǒng)計術后3個月時各分組MBR≥2 mm的位點頻數(shù)。種植體MBR定義為種植體肩臺（或種植體基臺連接處）到種植體骨結合界面最冠方點之間的距離，CBR定義為連接2個種植體平臺外側(cè)點的連線中心點到骨嵴頂?shù)拇咕€距離。所有數(shù)據(jù)由同一測量者不同日重復測量3次所得。

1.2.6 硬組織切片和VG染色種植術后3個月，將實驗動物處死，4%多聚甲醛溶液行內(nèi)固定。樣本經(jīng)過乙醇梯度脫水后進行硬組織切片，最終得到的硬組織切片厚度約為50 μm，按1∶9的比例混合復紅染色液和PA溶液，配制成VG染色液，根據(jù)切片的著色程度染色0.5～3.0 min；棄去染色液，用95%的乙醇急速分化約數(shù)秒鐘；用二甲苯對組織進行透明，用中性樹脂封片，體視顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，對于連續(xù)變量資料選用單因素方差分析（one-way ANOVA test），對于二分類變量資料采用卡方檢驗分析，對于等級變量資料采用Kruskal-Wallis法秩和檢驗分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床觀察與臨床牙周指數(shù)結果

種植術后3個月，臨床檢查可見種植體周角化黏膜質(zhì)地堅韌，呈淡粉色，愈合帽周圍有不同厚度及面積的菌斑、軟垢附著，1 mm組間隙內(nèi)較2 mm組、3 mm組有更多的黃白色軟垢堆積。

術后3個月時，3組種植體周PD、BOP、PI結果均較基線點增加。術后3個月時的統(tǒng)計學結果顯示，1 mm組的PD明顯大于2 mm組和3 mm組，2 mm組和3 mm組PD的差異無統(tǒng)計學意義；相較于2 mm和3 mm組，1 mm組的PD在≥5 mm的級別中頻數(shù)最多，差異有統(tǒng)計學意義。術后3個月時，1 mm組的BOP陽性率最高，為81%，且明顯大于2 mm組和3 mm組。術后3個 月 時，1 mm組 的PI明 顯大于2 mm組和3 mm組；PI≥2分的位點頻數(shù)也明顯多于其余2組，在PI為2的分級中，3組頻數(shù)無明顯差異，而在PI為3的分級中，1 mm組的頻數(shù)明顯高于2 mm組和3 mm組。詳見圖2和表1。

圖2 臨床觀察和臨床牙周指數(shù)Figure 2 Clinical observation and clinical periodontal indexes

2.2 影像學觀察與測量

術后X線片示，術后3個月時，1 mm組種植體間的骨嵴頂高度較其他2組明顯下降，種植體螺紋與骨交界面影像致密，種植體中下段骨組織影像較致密，靠近嵴頂?shù)墓蔷壝芏容^周圍骨質(zhì)低。影像學測量結果示，同一間距組的CBR和MBR均隨著時間延長而增加，而隨著間距從1 mm到3 mm，骨吸收的量呈逐漸減少的趨勢。無論是CBR還是MBR，1 mm組的骨吸收量均大于2 mm組和3 mm組，且在各時間點的差異均有統(tǒng)計學意義，但2 mm組與3 mm組在各時間點的差異均無統(tǒng)計學意義。詳見圖3。同時，統(tǒng)計第3個月時各個分組的MBR，結果顯示，1 mm組中，MBR≥2 mm的頻數(shù)明顯多于3 mm組，差異具有統(tǒng)計學意義，而2 mm與3 mm組間的差異無統(tǒng)計學意義（表1）。

表1 臨床牙周指數(shù)和骨吸收量的頻率分布[n（%）]Table 1 Frequency distribution of sites with clinical periodontal indexes and bone resorption[n（%）]

圖3 X線片和骨吸收量的測量Figure 3 X-ray radiograph and measurement of bone resorption

2.3 菌斑群落結構和多樣性分析結果

菌斑群落結構分析結果顯示，在菌屬的水平上，總體樣本中排名前5的分別是卟啉菌屬（Porphyromonas）、密螺旋體屬（Treponema）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、梭桿菌屬（Fusobacterium）。在3組樣本表達相對豐度排名前100的菌屬中，篩選出了4種有表達差異且與牙周疾病發(fā)展較密切的菌屬，分別是密螺旋體屬（Treponema）、坦納菌屬 （Tannerella）、普氏菌屬（Prevotella）和鏈球菌屬（Streptococcus）。其中，1 mm組的密螺旋體屬（Treponema）、坦納菌屬（Tannerella）和普氏菌屬（Prevotella）含量明顯高于3 mm組，1 mm組的鏈球菌屬（Streptococcus）含量明顯少于3 mm組，2 mm和3 mm組差異無統(tǒng)計學意義。詳見圖4。

圖4 種植體間距內(nèi)微生物群落結構分析Figure 4 Microbial community structure analysis of different distance groups

2.4 組織學觀察結果

VG染色結果顯示，3組的種植體和骨組織之間均形成了大面積的緊密接觸。1 mm組種植體-骨交界點到種植體肩臺的距離較2 mm組和3 mm組大，3 mm組骨嵴頂位置最高，且嵴頂骨皮質(zhì)延續(xù)。1 mm組間距內(nèi)骨小梁相對2 mm組和3 mm組稀疏，且1 mm組軟組織內(nèi)膠原纖維較少見，2 mm組軟組織內(nèi)膠原纖維排列散在、稀疏，而3 mm組軟組織內(nèi)膠原纖維排列有序、致密，并可見越隔纖維結構。詳見圖5。

圖5 VG染色的組織學觀察Figure 5 Histological observation by VG staining

3 討論

目前，關于種植體間距對骨吸收的影響尚未有共識性的結論。Scarano等[8]在實驗中將種植體間距分為2、3、4、5 mm組，除了2 mm組與3 mm組的比較外，其他分組間垂直性骨吸收的差異均有統(tǒng)計學意義。但亦有相關綜述得出垂直性骨吸收與種植體間距沒有統(tǒng)計學關聯(lián)的結論，而且最主要體現(xiàn)在2 mm與3 mm間距的比較中[9]。造成這種爭議可能與不同實驗種植體-基臺連接方式、動物模型或觀察時間等因素的不一致有關。本實驗影像學測量結果表明，CBR和MBR在1 mm組中明顯大于在2 mm組和3 mm組中，而2 mm組與3 mm組的差異沒有統(tǒng)計學意義。同時1 mm組的MBR在≥2 mm級別的頻數(shù)均明顯高于其他2組，組織學觀察結果也說明1 mm組的骨吸收最嚴重。本實驗從骨吸收的角度上說明了種植體間距越小，種植體周的炎癥程度就越重，相對于2 mm和3 mm組，1 mm組更有可能發(fā)生種植體周炎。

我們推測，本實驗中造成1 mm組骨吸收最明顯的原因主要有兩點。第一，與1 mm組的PI最大有關，當2枚植體距離越近，該位點的口腔自潔能力就越差，菌斑在此大量聚集。動物實驗表明，菌斑的積聚可形成上皮下結締組織內(nèi)炎性細胞浸潤，最終的炎性浸潤表現(xiàn)與天然牙炎癥表現(xiàn)類似[10]，從而加劇種植體間的骨吸收。第二，種植體間距小造成的水平性骨吸收在間距內(nèi)發(fā)生重疊，導致垂直骨高度下降。Tarnow等[4]的回顧性臨床試驗表明，種植體間距＜3 mm時，水平性骨吸收會造成更進一步的嵴頂骨吸收。此外，種植體間距過小還可能會造成間距內(nèi)骨組織微結構的改變，包括骨髓腔的減小和骨礦化程度的降低，以及間距內(nèi)血管體積密度的減小[11-12]，這些因素都可能會削弱骨組織對炎癥的自身抵抗能力，造成更明顯的骨吸收。骨吸收造成的深種植體周袋也會進一步促進細菌的定植和繁殖，最終導致種植體周炎的發(fā)生。

PD、PI、BOP都是用于診斷牙周炎和種植體周炎的常用指標，BOP陽性是種植體周黏膜炎的主要表現(xiàn)之一[13]。在評價種植體周健康狀況時，只有當PD變深時才有參考價值[7]。PI用來反映口腔衛(wèi)生狀況，PI越高表明牙周炎癥程度越重。本實驗中，術后3個月時，1 mm組的PD、BOP、PI明顯高于2 mm組和3 mm組，而且統(tǒng)計PD≥5 mm、BOP陽性及PI≥2的位點頻數(shù)后發(fā)現(xiàn)，1 mm組的位點頻數(shù)最高，表明1 mm組較其他2組更容易積聚菌斑，種植體周軟組織的炎癥程度也更嚴重，而2 mm組和3 mm組之間的差異無統(tǒng)計學意義。這從軟組織的角度上說明了1 mm的種植體間距更容易發(fā)生菌斑的積聚和種植體周的軟組織炎癥。

有報道指出，從種植體周炎位點分離的主要細菌為革蘭陰性桿菌和螺旋體[14]，而健康的種植體周球菌的數(shù)量占據(jù)優(yōu)勢。與牙周炎最密切相關的“紅色復合體”[15]包括牙齦卟啉單胞菌、福塞斯坦納菌、齒垢密螺旋體，這些特定細菌的增殖可能會改變特定部位的微生物生態(tài)，導致種植體周炎癥的發(fā)生。本實驗中，在種植體周組織炎癥程度更高的1 mm組中，密螺旋體屬、坦納菌屬和普氏菌屬的相對豐度較其他2組更高，而鏈球菌屬的相對豐度較其他2組低。這說明種植體間距過小不僅會增加間距內(nèi)的菌斑積累量，還可能會影響一部分與牙周炎癥相關細菌的相對表達量，進而打破宿主和微生物間的動態(tài)平衡，造成種植體周組織的破壞。

綜上所述，本實驗證明，相對于2 mm組和3 mm組，1 mm組PI更大，且發(fā)生了更明顯的軟組織炎癥和骨吸收，而2 mm組和3 mm組PI較小，并未發(fā)生明顯的骨吸收。因此，1 mm間距更容易發(fā)生種植體周炎。種植體間距越小，越容易增加種植體周菌斑的附著，應注重口腔衛(wèi)生的維護，同時對種植體周菌斑實施有效的控制措施，才能減少和阻斷種植體周疾病的發(fā)生。