楊麗寧 向蓉 王藝臻 張紅梅

甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州730000

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種常見的慢性代謝性疾病，其特點(diǎn)主要是血糖升高和代謝紊亂等，以及由此導(dǎo)致的全身組織、器官損害，嚴(yán)重危害人類的健康。山藥是薯蕷科植物薯蕷（Dioscorea opposite Thunb.）的干燥根莖，其性平、氣微、味淡、微酸，被列入我國傳統(tǒng)的藥食同源中藥目錄。中醫(yī)理論認(rèn)為，山藥具有固腎澀精、補(bǔ)益脾胃、生津益肺之功效［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，山藥具有調(diào)節(jié)血糖、保護(hù)胰島功能、降血脂、增強(qiáng)免疫力等多種藥理活性［2］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘山藥治療T2DM的主要成分及其作用靶點(diǎn)和通路，旨在為天然降血糖產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 山藥活性成分的獲取和篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索山藥的活性成分。以藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug-likeness，DL）為篩選條件，設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18的成分為有效活性成分。

1.2 山藥活性成分的作用靶點(diǎn)及T2DM作用靶點(diǎn)的獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢山藥有效活性成分的作用靶點(diǎn)，利用UniProt數(shù)據(jù)庫對活性成分靶基因的名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中以“type 2 diabetes mellitus”為搜索詞，查詢T2DM相關(guān)的作用靶點(diǎn)。

1.3 山藥治療T2DM潛在靶點(diǎn)的獲取 通過Venny2.1.0在線軟件獲得山藥有效活性成分與T2DM共同作用靶點(diǎn)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建藥物活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并對其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺，物種選擇“Homo sapiens”，結(jié)合分值設(shè)定為0.9，構(gòu)建山藥治療T2DM的PPI網(wǎng)絡(luò)。將該網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，篩選出山藥治療T2DM的核心靶點(diǎn)。

1.5 生物通路富集分析 采用基因注釋工具DAVID 6.8對PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，預(yù)測山藥治療T2DM的分子機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 山藥有效活性成分及作用靶點(diǎn)的獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢到71種山藥已知成分，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，得到16個有效活性成分，144個作用靶點(diǎn)；經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶基因的名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，去除數(shù)據(jù)庫中沒有預(yù)測靶點(diǎn)的活性成分并排除重復(fù)后，最終得到12個化合物、72個靶點(diǎn)。見表1。

表1 山藥的活性成分

2.2 山藥治療2型糖尿病潛在靶點(diǎn)的獲取 通過檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得T2DM靶點(diǎn)基因9948個，設(shè)定Score大于中位數(shù)的靶點(diǎn)為T2DM的潛在靶點(diǎn)，最終得到T2DM作用靶點(diǎn)1986個，與山藥有效活性成分靶點(diǎn)取交集后，得到41個共同靶基因。見圖1。

圖1 山藥—T2DM共同靶基因的韋恩圖

2.3 “藥物活性成分-共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將41個交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物活性成分-共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。度值較高的化合物有薯蕷皂苷元（diosgenin）、海風(fēng)藤酮（Kadsurenone）等，這些化合物可能是山藥治療T2DM的關(guān)鍵化合物。

圖2 山藥治療T2DM的“藥物活性成分-共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將得到的41個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，選取最低相互作用閾值大于0.9的靶點(diǎn)，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，得到度值排名前20的靶點(diǎn)，見圖3。進(jìn)一步篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中自由度、介數(shù)、中心度數(shù)均大于平均數(shù)的核心靶點(diǎn)蛋白有：AKT1、NR3C1、RELA、NOS2、SAA1。推測這些靶點(diǎn)可能是山藥治療T2DM的關(guān)鍵靶點(diǎn)。見圖4。

圖3 度值排名前20的靶點(diǎn)

2.5 GO富集分析 將41個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析，得到具有顯著意義的46個生物過程（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05），其中屬于BP的20個，主要包括肽基谷氨酸羧化（peptidyl-glutamic acid carboxylation）、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、對熱的反應(yīng)（response to heat）、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)（cellular response to hypoxia）、對雌二醇的反應(yīng)（response to estradiol）等。屬于CC的6個，包括突觸后、小窩、蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞表面、質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠。屬于MF的20個，主要包括轉(zhuǎn)錄激活子活性，RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)域序列特異性結(jié)合、酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合等。結(jié)果如圖5所示。

圖5 共同靶點(diǎn)的GO富集分析圖

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG富集分析結(jié)果顯示，具有顯著意義的通路共21條（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05），其中與T2DM相關(guān)度較高的通路主要包括腫瘤、炎癥、胰島素抵抗等。見圖6。

圖6 KEGG富集分析氣泡圖

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析探討山藥治療T2DM的分子機(jī)制。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出12個山藥有效活性成分，對應(yīng)72個靶點(diǎn)，與T2DM作用靶點(diǎn)進(jìn)行維恩分析，得到41個共同靶點(diǎn)，通過構(gòu)建“藥物活性成分-共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，預(yù)測山藥的關(guān)鍵活性成分可能為薯蕷皂苷元、海風(fēng)藤酮等。薯蕷皂苷元是一種具有非常高生物活性的天然甾體皂甙元，其治療糖尿病及其并發(fā)癥的研究已被廣泛報道。研究表明，薯蕷皂苷元可以改善葡萄糖耐量和血脂水平，減少IL-1β，IL-6和TNF-α的產(chǎn)生，還能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激的相關(guān)靶標(biāo)和途徑，從而改善糖尿病及其并發(fā)癥［3-4］。海風(fēng)藤酮是一種木脂素類化合物，具有較強(qiáng)拮抗血小板活化因子的活性、清除氧自由基、保護(hù)細(xì)胞膜免受活性氧自由基損傷等藥理活性［5］。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析可得，山藥治療T2DM的核心靶點(diǎn)主要為：AKT1、NR3C1、RELA、NOS2、SAA1。其中AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又稱蛋白激酶B，可以調(diào)控胰島素PI3K-AKT信號通路，從而調(diào)控葡萄糖和脂質(zhì)代謝［6］。血清皮質(zhì)酮和糖皮質(zhì)激素受體基因（NR3C1）多態(tài)性與人類血糖異常相關(guān)［7］。RELA是體內(nèi)重要的致炎因子，可調(diào)控細(xì)胞凋亡及炎癥應(yīng)答反應(yīng)。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS2）基因在T2DM易感性中起重要作用，其多態(tài)性被認(rèn)為可能是糖尿病腎病的遺傳危險因素［8］。血清淀粉樣蛋白A（SAA）是一種急性期蛋白復(fù)合物，具有載脂蛋白特性，由幾種豐富的同工型組成。研究表明，2型糖尿病初發(fā)或明顯腎病患者SAA升高，且SAA與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，B類I清除劑受體（SR-BI）介導(dǎo)的膽固醇向血清外排有關(guān)［9］。GO功能富集分析顯示，山藥治療T2DM涉及到肽基谷氨酸羧化、一氧化氮生物合成、對熱的反應(yīng)、對缺氧的反應(yīng)等生物過程，有突觸后、小窩、蛋白質(zhì)復(fù)合物等細(xì)胞組分參與，可能通過結(jié)合酶、蛋白質(zhì)、受體等物質(zhì)發(fā)揮抗T2DM的作用。

KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，山藥活性成分治療T2DM的主要信號通路有：缺氧誘導(dǎo)因子1信號通路、癌癥途徑、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、PI3K-Akt信號通路和胰島素抵抗，其中HIF-1信號通路是富集到的最顯著的信號通路，該通路可能是山藥治療糖尿病的重要機(jī)制之一。HIF-1信號通路是機(jī)體低氧應(yīng)激反應(yīng)時的主要靶點(diǎn)。研究表明，抑制糖尿病小鼠HIF-1α的表達(dá)，能抑制RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，降低血清MDA表達(dá)、促進(jìn)SOD的釋放，從而降低糖尿病小鼠的血糖水平［10］。癌癥途徑主要與癌癥疾病相關(guān)，與該通路相關(guān)的靶基因有11個，提示癌癥可能與T2DM存在某些共同的靶基因。調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解、胰島素抵抗這些通路都直接與糖脂代謝有關(guān)。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)，具有強(qiáng)大的調(diào)控血管形成能力，在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用［11-12］。PI3K-Akt信號通路是一條經(jīng)典的胰島素代謝通路，同時在炎癥反應(yīng)中也有很大作用［13］。山藥還可調(diào)節(jié)其他多條通路，說明其可通過多靶點(diǎn)，多途徑發(fā)揮治療T2DM的作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對山藥治療T2DM的有效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、顯著信號通路進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其主要活性成分一方面可直接調(diào)節(jié)糖脂代謝，對T2DM起到治療作用，另一方面還可以調(diào)控細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等，間接發(fā)揮治療作用。本研究為天然藥食同源中藥產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。