黃燕 戴余雯 周素琴 袁麗 徐麗波 李待軍

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州730030；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州730000

赤芍桃仁顆粒是我院院內(nèi)制劑，批準(zhǔn)文號(hào)為甘藥制字Z04000822，由赤芍、桃仁等6味中藥組成，具有清熱涼血、散風(fēng)解表、活血通經(jīng)、通竅止痛等功效，主要用于治療扁平疣、傳染性軟疣、尖銳濕疣等病毒性皮疣及帶狀皰疹后神經(jīng)痛、斑禿等，經(jīng)多年臨床應(yīng)用，療效顯著［1-2］。方中赤芍、桃仁清熱涼血，散瘀止痛；白芷消腫排膿，解表散寒，通鼻竅；川芎活血行氣，祛風(fēng)止痛。本文根據(jù)赤芍桃仁顆粒的給藥途徑和處方［3］，對(duì)該制劑進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性研究，希望建立可靠的赤芍桃仁顆粒的微生物限度檢查方法，以期為質(zhì)檢部門(mén)提供微生物限度檢查和質(zhì)量控制的依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 供試品 赤芍桃仁顆粒共三個(gè)批號(hào)，1∶20181015、2∶20181110、3∶20181112，規(guī)格10g×10袋/盒。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液（C18072011-2），pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（20180315）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，20181018）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，20180125）、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（20180818）、RV沙門(mén)增菌液體培養(yǎng)基（20180916）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，2018 0115）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（20190308）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，20190124）、麥康凱液體培養(yǎng)基（Mac B，20190118）、麥康凱瓊脂平板（Mac A，2010111）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（20190129），培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博科技生物公司。

1.3 菌種 白色念珠菌［CMCC（F）98001］、乙型副傷寒沙門(mén)菌［CMCC（B）50094］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、黑曲霉菌［CMCC（F）98003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）44104］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，以上菌種購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院。

1.4 儀器 XSZ205型電子天平（梅特勒）、BSC-1304II A2型生物安全柜（蘇州安泰）、SPX-80B型生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)）、AE2000型顯微鏡（麥克奧迪）、YX280A型壓力消毒器（上海三申）。

2 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.1 菌液制備 選pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌、枯草芽孢桿菌分別制成濃度為104、103、102cfu/mL的菌懸液；選0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液將白色念珠菌、黑曲霉菌制成濃度為104、103、102cfu/mL的菌懸液。菌種為第3代，菌懸液為第4代［4-5］。

2.2 菌懸液數(shù)量［3］取“2.1”項(xiàng)下各菌懸液1mL，置無(wú)菌平皿中，分別加TSA、SDB，平行制備2組，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。測(cè)定菌數(shù)。

2.3 供試液的制備 取赤芍桃仁顆粒10g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL，溶解，混勻，制成1∶10供試液。

2.4 回收比值

判斷方法：結(jié)果在0.5～2.0范圍內(nèi)，表明該計(jì)數(shù)方法適用性通過(guò)［6-7］。

2.5 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)［8-9］。

2.5.1 試驗(yàn)組。平皿法：分別取1∶10供試液10mL，加入已滅菌的7個(gè)三角瓶中，分別加入0.1mL“2.1”項(xiàng)下的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌懸液，制成每mL供試液含菌數(shù)小于100cfu，搖勻，取樣1mL，置無(wú)菌平皿中，平行制備2組，加TSA，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，測(cè)定菌數(shù)。取含白色念珠菌、黑曲霉菌樣品溶液各2mL，置無(wú)菌平皿中，加SDA，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，測(cè)定菌數(shù)。

培養(yǎng)基稀釋法：取“2.3”項(xiàng)下供試液10mL 3份，分別加0.1mL“2.1”項(xiàng)下白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌懸液，制成每mL供試液含菌數(shù)小于100cfu，搖勻，取樣0.2、0.5mL，置無(wú)菌平皿中，平行制備2組，分別加TSA、SDA，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，測(cè)定菌數(shù)。

供試液稀釋法：取“2.3”項(xiàng)下供試液10mL加入無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，制成1∶100供試液，取10mL，加入白色念珠菌0.1mL菌懸液（103cfu/mL），制成每mL含菌數(shù)小于100cfu，取1mL，置無(wú)菌平皿中，平行制備2組，加SDA，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，測(cè)定菌數(shù)。

2.5.2 菌液對(duì)照組。取“2.1”項(xiàng)下的菌懸液（104cfu/mL）進(jìn)行100級(jí)稀釋，取1mL注皿，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌加TSA，白色念珠菌、黑曲霉菌加SDA，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，測(cè)定菌數(shù)。

2.5.3 供試品對(duì)照組。取赤芍桃仁顆粒1∶10、1∶100供試液按表1取樣注皿，其他操作同試驗(yàn)組，測(cè)定菌數(shù)。

2.5.4 陰性對(duì)照組。用同批配制、滅菌的TSB1mL替代樣品溶液注皿，其他操作同試驗(yàn)組，測(cè)定陰性對(duì)照菌數(shù)。

2.5.5 不同計(jì)數(shù)法比較［10］。采用1∶10供試液平皿法，銅綠假單胞菌、黑曲霉回收比值高于0.5，白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌回收比值低于0.5，證明該方法不可行。采用1∶10供試液培養(yǎng)基稀釋法0.2mL注皿，對(duì)應(yīng)試驗(yàn)菌回收比值高于0.5，證明該方法可消除赤芍桃仁顆粒對(duì)需氧菌的抑菌作用。采用供試液稀釋法（1∶100，1mL/皿），白色念珠菌、黑曲霉菌回收比值高于0.5，表明該方法可消除赤芍桃仁顆粒對(duì)霉菌和酵母菌的抑菌作用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同計(jì)數(shù)法適用性試驗(yàn)結(jié)果（n=2）

2.6 控制菌檢查［11，12］

2.6.1 大腸埃希菌。取4份100mL TSB，1瓶加大腸埃希菌菌懸液1mL（102cfu/mL）和“2.3”項(xiàng)下供試液10mL，作為試驗(yàn)組；2瓶加“2.3”項(xiàng)下供試液10mL，作為供試品組；3瓶加大腸埃希菌菌懸液1mL（102cfu/mL），作為陽(yáng)性對(duì)照組；4瓶以pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，作為陰性對(duì)照組。上述4組，35℃培養(yǎng)24h。取各培養(yǎng)物1mL，接種至100mLMac B中，44℃培養(yǎng)48h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于MacA平板上，35℃培養(yǎng)72h。

2.6.2 耐膽鹽革蘭氏陰性菌。取赤芍桃仁顆粒10g，加100mL TSB，制成1∶10供試液，混勻，25℃培養(yǎng)2h（不增值）。取上述培養(yǎng)物2份各10mL，接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基，1瓶加大腸埃希菌菌懸液1mL（102cfu/mL），2瓶加銅綠假單胞菌菌懸液1mL（102cfu/mL），均為試驗(yàn)組；3瓶加“2.3”項(xiàng)下供試液10mL和100mL TSB，作為供試品對(duì)照組；4瓶、5瓶分別加入大腸埃希菌菌懸液（102cfu/mL）、銅綠假單胞菌菌懸液（102cfu/mL）1mL，分別加入100mL TSB中，作為陽(yáng)性對(duì)照組；6瓶以pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，作為陰性對(duì)照組。將上述35℃培養(yǎng)48h，接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)24h。

2.6.3 沙門(mén)菌。取2份赤芍桃仁顆粒10g，分別加100mL TSB，制成赤芍桃仁顆粒1∶10供試液，其中1瓶加沙門(mén)菌菌懸液1mL（102cfu/mL）作為試驗(yàn)組；2瓶作為供試品組。3瓶只加沙門(mén)菌菌懸液1mL（102cfu/mL），作為陽(yáng)性對(duì)照組；4瓶以pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，作為陰性對(duì)照組。上述4組，35℃培養(yǎng)24h，取0.1mL培養(yǎng)液接種于10mL RV沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24h，劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，35℃培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)。

3 結(jié)果

3.1 計(jì)數(shù)方法 三批赤芍桃仁顆粒，需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)分別按培養(yǎng)基稀釋法和供試液稀釋法進(jìn)行驗(yàn)證回收試驗(yàn)。見(jiàn)表2。

表2 赤芍桃仁顆粒驗(yàn)證回收比值

采用培養(yǎng)基稀釋法（1∶10，0.2mL/皿）和供試液稀釋法（1∶100，1mL/皿）測(cè)定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，各試驗(yàn)菌回收比值均在0.5～2.0范圍內(nèi)，表明該微生物計(jì)數(shù)方法適用性驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)。

3.2 大腸埃希菌 三批赤芍桃仁顆粒，陽(yáng)性對(duì)照組均有菌落生長(zhǎng)，經(jīng)鏡檢，確定該菌為大腸埃希菌，而陰性和供試品對(duì)照組無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明該方法可用于控制大腸埃希菌。見(jiàn)表3。

表3 大腸埃希菌驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3.3 耐膽鹽革蘭氏陰性菌 三批赤芍桃仁顆粒，陽(yáng)性對(duì)照組均有菌落生長(zhǎng)，經(jīng)鑒定，該菌為所加陽(yáng)性菌，而陰性和供試品對(duì)照組未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明該方法對(duì)大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的選擇性良好，可用于控制耐膽鹽革蘭氏陰性菌。見(jiàn)表4。

表4 耐膽鹽革蘭氏陰性菌驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3.4 沙門(mén)菌 三批赤芍桃仁顆粒，試驗(yàn)組有菌落生長(zhǎng)，鏡檢確認(rèn)為該陽(yáng)性菌，而陰性和供試品對(duì)照組未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明該方法可用于沙門(mén)菌的檢驗(yàn)。見(jiàn)表5。

表5 沙門(mén)菌驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

醫(yī)院自制制劑因其生產(chǎn)工藝、設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，且當(dāng)制劑中含有抑菌成分藥材時(shí)，檢測(cè)的結(jié)果常常會(huì)出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，因此進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性驗(yàn)證至關(guān)重要。赤芍桃仁顆粒為含有藥材原粉的中藥復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，若要保證檢查方法的有效性和準(zhǔn)確性，必須驗(yàn)證其微生物限度方法的適宜性。處方中赤芍、白芷、川芎等均具有抑菌作用。有文獻(xiàn)報(bào)道［13］，赤芍的不同提取物具有明顯的抑菌活性，且可與抗生素產(chǎn)生協(xié)同作用。白芷不僅對(duì)白色念珠菌具有明顯的抑制作用，而且對(duì)白色念珠菌毒力因子CPH1、EFG1表達(dá)過(guò)程產(chǎn)生抑制作用，有文獻(xiàn)資料報(bào)道，白芷對(duì)白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌活性顯著［14-15］。川芎取物在濃度為1g/mL時(shí)對(duì)受試病原細(xì)菌大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、青枯菌、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎雙鏈菌均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制活性，其中以沙門(mén)氏菌對(duì)提取物最敏感，其次是青枯菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和肺炎雙鏈菌對(duì)提取物的敏感性相對(duì)較弱［16］。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，赤芍桃仁顆粒首先采用1∶10稀釋并吸取1mL、0.5mL分別計(jì)數(shù)，但試驗(yàn)結(jié)果回收比值均不在規(guī)定范圍。本文改善了樣品處理方法，供試液稀釋法和培養(yǎng)基稀釋法很好的消除了赤芍桃仁顆粒處方組分中的抗菌活性。

綜上所述，赤芍桃仁顆粒的微生物限度檢查方法適用性實(shí)驗(yàn)合格，符合2020年版《中國(guó)藥典》四部的要求［17］，可以為赤芍桃仁顆粒更好的控制質(zhì)量提供有力依據(jù)。