王玉帛 宋黎橋 楊潔瑩 李敏 劉斌

蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000

齲病是全球最常見的慢性病，全球約有39億人受其影響［1，2］，其主要臨床特征表現(xiàn)在牙體表面硬組織的漸進(jìn)性改變。研究表明，口腔微生物群是齲病的重要決定因素，其中變形鏈球菌（Streptococcus mutans，SM）是世界范圍內(nèi)齲齒（蛀牙）的主要原因，是所有口腔鏈球菌中最容易致齲的菌，其黏附、聚集于由唾液蛋白所形成的生物膜上，產(chǎn)酸并耐酸，形成酸性微環(huán)境侵蝕牙釉質(zhì)造成脫礦，進(jìn)而侵襲牙本質(zhì)導(dǎo)致齲病的發(fā)生［3］。因此，降低SM的數(shù)量、減少其酸性物質(zhì)的合成以及阻止牙菌斑生物膜的形成對(duì)齲病的防治至關(guān)重要。有研究表明，甘草對(duì)于口腔相關(guān)的多種慢性感染性疾病具有優(yōu)良的預(yù)防及治療效果。光果甘草屬于藥用甘草，其中含有一種三萜皂苷類化合物即甘草甜素，甘草甜素能夠抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而抑制胞外多糖的合成，通過降低牙菌斑生物膜的形成來抑制SM的活性［4］，并且其抑制效果優(yōu)于氯己定和含氟漱口水［5］。多項(xiàng)研究證實(shí)甘草棒棒糖具有良好的預(yù)防齲齒的效果［6-9］。自然狀態(tài)下，細(xì)菌常以生物膜和浮游狀態(tài)生存，而甘草甜素對(duì)處于生物膜狀態(tài)SM的抑制活性研究較少，本實(shí)驗(yàn)擬研究甘草甜素對(duì)變形鏈球菌在浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)下的抑制活性，旨在探究甘草甜素對(duì)兩種不同狀態(tài)下SM的抑菌效果及可能的機(jī)制，為尋找預(yù)防和治療齲病的天然活性物質(zhì)提供基礎(chǔ)及背景資料。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 甘草甜素（梯系愛酶化成工業(yè)發(fā)展有限公司，CAS號(hào)為1405-86-3）；BHI培養(yǎng)基（北京索萊寶生物科技有限公司，LA0360-250g）；DAPI熒光染劑（北京索萊寶生物科技有限公司，C0060）；二甲基亞砜DMSO（北京索萊寶生物科技有限公司，D8370）；瓊脂粉（北京索萊寶生物科技有限公司，A8190）；一次性無菌接種環(huán)（上海玉博生物科技有限公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（瑞士帝肯，Infinite 200 pro）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅）；厭氧工作站（美國(guó)GeneScience，AG300）；倒置相差熒光顯微鏡（日本奧林巴斯，CKX53）；微量離心機(jī)（德國(guó)賽多利斯，A-14C）；酸度計(jì)（瑞士梅特勒-托利多，five easy plus系列）；37℃恒溫振蕩器（常州國(guó)華，ZD-85）；電子pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多，F(xiàn)E20）。

1.2 實(shí)驗(yàn)種、菌液制備及分組 SM取樣于實(shí)驗(yàn)室保存菌種，在變形鏈球菌的BHI固體培養(yǎng)基上用一次性無菌接種環(huán)挑取一個(gè)單菌落，接種于3mL BHI液體培養(yǎng)基中，放在37℃恒溫振蕩器中復(fù)蘇48h，分光光度計(jì)調(diào)定菌懸液濃度為106CFU/mL（A600nm=0.2）。用蒸餾水將甘草甜素配置成濃度為300μg/mL的母液，用0.22μm無菌濾器過濾后避光儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。用BHI液體培養(yǎng)基將甘草甜素母液按二倍梯度稀釋法倍比稀釋作為實(shí)驗(yàn)組；將不加藥液的BHI液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照組（negative control group，NC）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 甘草甜素對(duì)浮游菌生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)。在96孔板每一列的孔中分別加入20μL菌懸液及180μL梯度稀釋的藥液（GL的濃度分別為300、150、75、37.5、18.75及9.375μg/mL），于80%N2，20%CO2，37℃厭氧工作站中培養(yǎng)24h。在黑背景下，觀察未見渾濁的最低藥物濃度為其最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。隨后將未渾濁孔中的藥液分別接種100μL于BHI固體培養(yǎng)基中，在80%N2，20%CO2，37℃厭氧工作站中培養(yǎng)24h，觀察變形鏈球菌的生長(zhǎng)情況，以無菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為該藥的最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）［10］。

1.3.2 甘草甜素對(duì)浮游菌產(chǎn)酸抑制實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置四個(gè)濃度：MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，對(duì)照組為等量的BHI液體培養(yǎng)基。在各組中分別加入1mL的藥液，再分別加入來自同一試管培養(yǎng)24h的變形鏈球菌菌懸液100μL，測(cè)定初始pH值。在80%N2、20%CO2、37℃厭氧工作站中孵育24h，8000rpm/min，4℃，離心30min后，檢測(cè)上清液的pH值，作為終末pH值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。ΔpH=初始pH值-終末pH值。

1.3.3 甘草甜素對(duì)浮游菌黏附抑制實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置四個(gè)濃度（同1.3.2）在無菌試管中分別加入來自同一試管培養(yǎng)24h的500μL變形鏈球菌菌懸液，再分別加入四個(gè)藥物濃度的藥液，陰性對(duì)照組的試管中只加入BHI液體培養(yǎng)基。將試管與水平面成30°放置，80%N2、20%CO2、37℃厭氧工作站中培養(yǎng)24h。取出試管，將試管（試管1）輕柔旋轉(zhuǎn)3圈，菌液倒入另一無菌試管（試管2）中，接著從試管1無細(xì)菌黏附側(cè)加入1.5mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS），輕柔旋轉(zhuǎn)3圈后，將沖洗液倒入另一無菌試管（試管3）中，隨后將試管2和3以8000r pm/min離心15min，棄去上清液，在試管1、2和3中分別加入1.5mL PBS緩沖液，震蕩混勻。使用酶標(biāo)儀在590nm處測(cè)定各試管的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，三批試管對(duì)應(yīng)的均值分別記為A1、A2、A3。

通過平均值計(jì)算不同濃度的甘草甜素藥液作用下變形鏈球菌的黏附率及黏附抑制率變化，細(xì)菌黏附率的計(jì)算公式為：A1/（A1+A2+A3）×100%，黏附抑制率=（陰性對(duì)照組的黏附率-實(shí)驗(yàn)組的黏附率）/陰性對(duì)照組的黏附率×100%。

1.3.4 甘草甜素對(duì)變形鏈球菌生物膜影響的體外實(shí)驗(yàn)。在24孔板中放入已消毒的蓋玻片（8mm×8mm），加入新鮮的濃度為106CFU/mL的菌液200μL，每3個(gè)縱行為平行一組，實(shí)驗(yàn)組為最小抑菌濃度（MIC）的甘草甜素1.8mL，陰性對(duì)照組（NC）為等體積的BHI液體培養(yǎng)基。于80%N2、20%CO2、37℃厭氧工作站中孵育24h，構(gòu)建24h變形鏈球菌生物膜。24h后用移液槍吸去24孔板中的液體，用PBS緩沖液沖洗3次，以去除表面的浮游細(xì)菌。按照DAPI熒光染色試劑盒的說明配制熒光染液，于避光暗室中，在變形鏈球菌生物膜表面滴加200μL的DAPI熒光染液，孵育20min后用PBS沖洗3次以洗去未結(jié)合的染料。置于倒置相差熒光顯微鏡下用UV激發(fā)波長(zhǎng)觀察生物膜的結(jié)構(gòu)［11］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的連續(xù)變量以（±s）表示，若滿足正態(tài)性和方差齊性，采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.001。

2 結(jié)果

2.1 甘草甜素對(duì)變形鏈球菌MIC和MBC的測(cè)定結(jié)果在黑色背景下甘草甜素濃度為75μg/mL時(shí)菌液明顯變清，以此藥物濃度開始平板劃線，甘草甜素濃度為150μg/mL時(shí)平板上無細(xì)菌生長(zhǎng)。甘草甜素對(duì)變形鏈球菌的MIC值為75μg/mL，MBC值為150μg/mL，表明甘草甜素對(duì)浮游狀態(tài)下的變形鏈球菌具有抑制及殺滅作用。

2.2 甘草甜素對(duì)變形鏈球菌產(chǎn)酸的抑制 通過0h pH值、24h pH值和pH差值在MIC及亞濃度時(shí)對(duì)變形鏈球菌產(chǎn)酸的影響比較，顯示甘草甜素對(duì)變形鏈球菌產(chǎn)酸有抑制作用（P＜0.001）。見表1。

表1 不同濃度甘草甜素對(duì)變形鏈球菌產(chǎn)酸的影響（±s）

表1 不同濃度甘草甜素對(duì)變形鏈球菌產(chǎn)酸的影響（±s）

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2.3 甘草甜素對(duì)變形鏈球菌黏附的抑制 甘草甜素對(duì)變形鏈球菌黏附有抑制作用，不同濃度的甘草甜素對(duì)變形鏈球菌黏附的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖1和表2。

表2 不同濃度甘草甜素對(duì)變形鏈球菌黏附的影響（%，±s）

表2 不同濃度甘草甜素對(duì)變形鏈球菌黏附的影響（%，±s）

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圖1 不同濃度甘草甜素對(duì)變形鏈球菌黏附的抑制

2.4 混合液對(duì)變形鏈球菌生物膜活性的抑制 倒置相差熒光顯微鏡下，陰性對(duì)照組的變形鏈球菌生物膜結(jié)構(gòu)完整且致密，在MIC時(shí)生物膜結(jié)構(gòu)被破壞，藍(lán)色熒光面積顯著減少，表明表層細(xì)菌死亡脫落，降低了變形鏈球菌生物膜的活性。見圖2。

圖2 甘草甜素作用于變形鏈球菌24h生物膜的熒光顯微鏡圖像

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用96孔板液體梯度倍比稀釋法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測(cè)得MIC為75μg/mL，MBC為150μg/mL，表明甘草甜素對(duì)浮游狀態(tài)下的變形鏈球菌有一定的抑制作用。通過測(cè)定藥液中上清液的pH值差值，說明最小抑菌濃度和亞抑菌濃度的甘草甜素均具有抑制變形鏈球菌產(chǎn)酸能力。試管黏附試驗(yàn)結(jié)果表明，隨甘草甜素藥液濃度升高，變形鏈球菌對(duì)試管的黏附率逐漸降低。使用倒置相差熒光顯微鏡觀察經(jīng)DAPI染色的變形鏈球菌生物膜的差別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在最小抑菌濃度時(shí)，生物膜活性遭到明顯破壞。證實(shí)了甘草甜素對(duì)變形鏈球菌在浮游狀態(tài)下及生物膜狀態(tài)下的抑制作用。

隨著抗生素的濫用，很多細(xì)菌逐漸產(chǎn)生了耐藥性，近年來，天然植物的藥用受到國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注，并逐漸成為食品安全和新型醫(yī)學(xué)藥物研究的熱門方向。本研究通過證明甘草甜素具有抑制變形鏈球菌生長(zhǎng)，黏附及產(chǎn)酸等抗菌作用，為臨床預(yù)防、治療齲病及實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究提供了一定的依據(jù)。甘草甜素是近年來被廣泛應(yīng)用于中藥、食品、化妝品和煙草等領(lǐng)域的天然植物提取物之一，已有研究表明甘草甜素在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有下述作用：（1）抑制致齲微生物的活性：甘草甜素可以抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而抑制變形鏈球菌胞外多糖的合成，進(jìn)而抑制其生物膜的形成［12，13］；（2）作為防齲保健品：近些年來，國(guó)外研發(fā)出一款含有天然甘草提取物的棒棒糖，經(jīng)過多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)這種棒棒糖對(duì)于變形鏈球菌有很強(qiáng)的體外抑制作用［13，14］；（3）作為根管消毒劑：有文獻(xiàn)報(bào)道，甘草甜素復(fù)合物可抑制牙髓內(nèi)病原體并且對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞的生物相容性較好［15］。本研究?jī)H在體外環(huán)境中證明了甘草甜素對(duì)變形鏈球菌浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)的抑制作用，但是在體內(nèi)是否同樣會(huì)對(duì)變形鏈球菌產(chǎn)生抑制效果，還有待進(jìn)一步研究。