王建茹，朱明軍，王永霞，彭廣操

河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

《中國心血管病報告2018》顯示，我國心血管病患者多達2.9億，防治心血管病給我國帶來了嚴重的社會和醫(yī)療資源負擔［1］。急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的一種急危重表現(xiàn)。近幾十年來，隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展和生活方式的巨大變化，AMI急劇增加，已成為我國居民住院和死亡的主要原因［2］。早期快速恢復冠狀動脈血流可減少心肌梗死的面積，防止進一步組織損傷。溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）等再灌注策略的發(fā)展，極大降低了AMI后短期的病死率，但卻增加了心肌缺血再灌注損傷（myocardium ischemia-reperfusion injury，MIRI）的發(fā)病率，加重了心臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷，最終可引起多種不良心血管結(jié)局［3］。因此，積極發(fā)掘有效延緩或逆轉(zhuǎn)MIRI的措施，具有十分重要的臨床和社會意義，一直是心血管領(lǐng)域研究的重點和熱點。

中藥復方具有多成分、多靶點、多途徑和多效應(yīng)的特點，在治療疾病方面表現(xiàn)出療效確切、不良反應(yīng)小的優(yōu)勢，但其作用機制研究是一直以來的重點和難點［4］?，F(xiàn)階段，研究中藥對某種疾病的作用機制，很難進行系統(tǒng)全面的研究，大多從單靶點或單一通路切入。網(wǎng)絡(luò)藥理學因具有整體性和系統(tǒng)性的特點，迎合中醫(yī)學的整體觀念，能更好地闡釋中藥復方治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用機制，已成為研究中藥的新技術(shù)方法，并產(chǎn)生了一系列新的研究數(shù)據(jù)和成果［5］。分子對接技術(shù)作為一種廣泛使用的虛擬篩選方法，可研究小分子配體與受體間的相互作用，預(yù)測其結(jié)合模式及親和力［6］?，F(xiàn)階段，多項研究均采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)探討中藥治療某種疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，并確定了這些技術(shù)方法的科學性和可行性［7-8］。芪參益氣滴丸包括黃芪、丹參、三七和降香4味藥，具有益氣通脈，活血止痛的作用。目前，芪參益氣滴丸在臨床上已廣泛用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、PCI術(shù)后心肌損傷等多種心血管疾病的治療，并表現(xiàn)出了良好的臨床應(yīng)用前景，但其生物分子機制尚需深入的探索研究［9-11］。

基于以上認識，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)，揭示芪參益氣滴丸改善MIRI的有效活性成分和潛在分子機制，以期為后續(xù)的基礎(chǔ)實驗研究提供新的研究思路，為臨床研究提供一定的客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）；PubChem數(shù) 據(jù) 庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//swisstargetprediction.ch/）；GenCLiP 3數(shù)據(jù)庫（http：//ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）；GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）；OMIM數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/）；Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）；STRING數(shù) 據(jù) 庫（https：//string-db.org/）；Veney 2.1軟件；Cytoscape 3.7.2軟件；R 3.6.1軟件；PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb/）；PyMOL 2.2.0軟件；ChemBioDraw 2014軟件；Discovery Studio 4.5軟件；Autodock vina1.1.2軟件；Autodock Tools 1.5.6軟件等。

1.2 方法

1.2.1 獲取并篩選芪參益氣滴丸中相關(guān)化學成分及作用靶點在TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集芪參益氣滴丸中黃芪、丹參、三七、降香的全部化學成分，收集相應(yīng)化合物的預(yù)測作用靶點?？诜锢枚龋╫ral bioavailability，OB）是藥物成分毒藥物動力學（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）屬性中最重要的藥動學參數(shù)之一，代表口服藥物的有效成分到達人體循環(huán)系統(tǒng)的速度和程度，是評價藥物能否發(fā)揮藥效的重要指標。類藥性（drug likeness，DL）代表化合物成分與已知化學藥的相似性，對確定中藥成分是否對機體產(chǎn)生活性具有重要參考價值，DL值越高提示化合物的理化性質(zhì)越穩(wěn)定，藥動學性質(zhì)越好。本研究將OB≥30%和DL≥0.18作為條件進行篩選［8，12-14］。同時，在PubChem數(shù)據(jù)庫中檢索獲取的芪參益氣滴丸所有活性成分的Canonical SMILES結(jié)構(gòu)。然后，在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫對芪參益氣滴丸活性成分的作用靶點進行預(yù)測，并以概率≥0.3為閾值進行靶點篩選。

1.2.2 篩選與MIRI相關(guān)作用靶點在Gene-Cards、OMIM、GenCLiP 3數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞心肌缺血再灌注損傷的英文名稱即“myocardial ischemic reperfusion injury”；“myocardial ischemic-reperfusion injury”；“myocardial ischemia-reperfusion injury”；“myocardial ischemia reperfusion injury”檢索已報道的與MIRI相關(guān)的靶點。

1.2.3 獲取芪參益氣滴丸-MIRI共同作用靶點利用Uniprot數(shù)據(jù)庫對所有作用靶點進行標準化規(guī)范。將芪參益氣滴丸中所有活性成分的作用靶點與MIRI相關(guān)作用靶點導入Veney 2.1軟件中取交集，獲取芪參益氣滴丸-MIRI共同作用靶點，并繪制韋恩圖。

1.2.4 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)并篩選核心靶點將1.2.3項下得到的共同靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫中，互作得分設(shè)置為最高置信度≥0.900，進行蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，并將結(jié)果保存為tsv格式。將導出的tsv文件中的node1、node2和combined score信息導入Cytoscape3.7.2軟件中繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，用Network Analyzer工具進行網(wǎng)絡(luò)分析，利用Generate style from statistics工具對節(jié)點大小和顏色進行設(shè)置用于反映度值的大小，對邊的粗細進行設(shè)置用于反映Combine score的大小。將select選項下Node：degree的最小值設(shè)置為平均自由度的2倍，篩選核心靶點，最后選取新的核心PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 核心靶點富集分析利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將1.2.4項下篩選出的核心靶點的Uniprot號轉(zhuǎn)換為entrez號。在R語言的環(huán)境下，利用org.Hs.eg.db、clusterProfiler、enrichplot等R程序包對核心靶點進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并繪制條形圖和氣泡圖進行可視化。

1.2.6 中藥-成分-靶標-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)合已報道的文獻研究，篩選出前30條通路中與MIRI最相關(guān)的通路，并找出富集在這些通路上的核心靶點。在Excel表中分別構(gòu)建芪參益氣滴丸“中藥-活性成分”“活性成分-靶點”“靶點-通路”文件，并將以上文件輸入Cytoscape3.7.2軟件中，構(gòu)建中藥-成分-靶標-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.2.7 分子對接將degree排名前5位的核心靶點與其所對應(yīng)的活性成分進行分子對接。首先，從PDB數(shù)據(jù)庫中檢索人源核心靶點的PDB號并下載pdb格式的蛋白結(jié)構(gòu)，用PyMOL軟件去除蛋白結(jié)構(gòu)中的水分子、配體等，Auto dock Tools加氫，然后轉(zhuǎn)換成pdbqt格式。其次，從Chempub數(shù)據(jù)庫中下載各活性成分的分子結(jié)構(gòu)，保存為SDF格式，再用ChemBio3D進行優(yōu)化，保存為mol2格式。最后，利用Autodock Vina軟件進行分子對接，獲取結(jié)合能值，對接結(jié)果采用Discovery Studio Visualizer 4.5和PyMOL軟件進行可視化。結(jié)合能數(shù)值為負則提示活性成分與核心作用靶點可自由結(jié)合，數(shù)值越小說明兩者的作用關(guān)系越可靠。本研究將＜-5 kcal·mol-1的結(jié)合能數(shù)值作為閾值，來佐證活性成分與核心靶點之間作用關(guān)系的可信度。

2 結(jié)果

2.1 芪參益氣滴丸化學成分及其作用靶點在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件進行篩選，丹參獲得65個活性成分，黃芪為20個，三七為8個，降香為37個。將這130個活性成分進行匯總剔除重復后共得到125個活性成分。將125個活性成分分別在TCMSP數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫進行靶點預(yù)測，剔除重復項后共獲得350個靶點。

2.2 疾病作用靶點從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到1 275個靶點；OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索到21個靶點；GenCLiP3數(shù)據(jù)庫中檢索到722個靶點，剔除重復項后共獲得1 475個與MIRI相關(guān)的作用靶點。

2.3 藥物-疾病作用靶點的預(yù)測將芪參益氣滴丸作用靶點與MIRI相關(guān)作用靶點，經(jīng)過Uniprot數(shù)據(jù)庫進行標準化后，導入Veney 2.1軟件中取交集并構(gòu)建韋恩圖（見圖1），最后共獲得181個共同作用靶點，即芪參益氣滴丸潛在改善MIRI的作用靶點。

圖1 芪參益氣滴丸-MIRI靶點韋恩圖

2.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點的篩選將181個共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫中進行蛋白互作關(guān)系分析，再使用Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包括157個節(jié)點、23 260條邊，平均Degree值為10.561，然后再以平均度值的2倍（22）進行第2次篩選，得到19個節(jié)點、342條邊的新的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，顏色越深、節(jié)點越大的圓形靶標節(jié)點表示度值越高，說明其在芪參益氣滴丸改善MIRI方面的作用越重要，其中19個節(jié)點即是核心作用靶點（見圖2、表1）。

圖2 芪參益氣滴丸改善MIRI共同作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表1 芪參益氣滴丸“藥物-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點

2.5 核心靶點富集分析在Uniprot數(shù)據(jù)庫中，將19個核心靶點的Uniprot號轉(zhuǎn)換為entrez號，然后利用R包進行富集分析。GO功能富集分析結(jié)果顯示，依據(jù)P≤0.05確定了1 871個GO條目。生物學過程（biological process，BP）條目最多為1 763條，主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、氧化應(yīng)激反應(yīng)等。分子功能（molecular function，MF）條目為77條，主要涉及磷酸酶結(jié)合、絲裂原活化蛋白激酶活性等。細胞組分條目（cellular component，CC）為31條，主要涉及核染色質(zhì)、膜筏等。圖3依據(jù)計算出的p.adjust顯著性列舉了3個模塊的前10個條目進行可視化。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，依據(jù)P≤0.05共映射出了146條信號通路，主要有癌癥相關(guān)通路、乙型肝炎、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號通路、Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號通路等。根據(jù)通路所涉及靶點數(shù)目和p.adjust的顯著性選取前30條通路，以氣泡圖的形式進行可視化，其中氣泡的大小代表該通路的靶點數(shù)目，氣泡顏色代表富集顯著性（見圖4）。

圖3 芪參益氣滴丸改善MIRI潛在核心靶點的GO富集分析條形圖

圖4 芪參益氣滴丸改善MIRI潛在核心靶點的KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6 中藥-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過文獻收集，在富集的前30條通路中篩選出了10條可能與MIRI相關(guān)的通路，即MAPKs信號通路、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）信號通路、TLRs信號通路、低氧誘導因子（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、ErbB信號通路、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號通路、松弛素信號通路、c型凝集素受體信號通路、T細胞受體信號通路、催乳激素信號通路。此外，KEGG富集分析結(jié)果中細胞凋亡、磷酸肌醇3激酶（Phosphoinositol 3 kinase，PI3K）-蘇氨酸蛋白激酶（threonine-protein kinases，AKT）信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號通路等雖未據(jù)前30位，但卻與MIRI的病理過程密切相關(guān)。將這10條通路與芪參益氣滴丸相應(yīng)的活性成分、作用靶點進行整合，構(gòu)建中藥-成分-靶標-通路網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。如圖5所示，紅色六邊形節(jié)點代表芪參益氣滴丸中的中藥，黃色三角形節(jié)點代表活性成分，藍色圓形節(jié)點代表潛在作用靶點，綠色V節(jié)點代表與MIRI密切相關(guān)的通路。由圖5可知，芪參益氣滴丸中的黃芪、丹參、三七、降香4味藥中的57個活性成分通過干預(yù)19個作用靶點參與以上10條信號通路。

圖5 芪參益氣滴丸的中藥-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對接結(jié)果為了驗證芪參益氣滴丸“中藥-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)”的預(yù)測結(jié)果，將核心作用靶點中度值排名前5位的靶點與其所對應(yīng)的活性成分進行分子對接，對接的參數(shù)設(shè)置及相應(yīng)的計算結(jié)果見表2。結(jié)果表明，提取出的16對“活性成分-作用靶點”關(guān)系中，芪參益氣滴丸的活性成分與5個核心作用靶點均存在不同程度的結(jié)合，結(jié)合自由能均＜-5 kcal·mol-1，提示篩選出的核心作用靶點與其對應(yīng)的活性成分具有良好的親和力，說明結(jié)果具有一定的可信度。圖6為度值排名第2位的核心作用靶點TP53與其對應(yīng)活性成分的分子對接結(jié)果模擬圖，其中丹參酮IIA與TP53的結(jié)合能力最強。

圖6 TP53（1tsr）對接結(jié)果模擬圖

表2 活性成分與作用靶點分子對接參數(shù)及相應(yīng)計算結(jié)果

3 討論

西醫(yī)認為，MIRI的病理過程涉及鈣超載、細胞凋亡、能量代謝障礙、氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)等［15］。近年來，諸多研究已證實中藥及其復方制劑在改善MIRI方面表現(xiàn)出了明顯的臨床優(yōu)勢和應(yīng)用前景，其作用機制主要包括抗炎、抗氧化、抑制鈣超載、改善心肌能量代謝、抑制細胞凋亡等［16］。中醫(yī)學并沒有MIRI概念的描述和記載，鑒于MIRI為AMI行PCI術(shù)后發(fā)生的重要病理過程，且臨床常表現(xiàn)為心功能減退和心梗面積擴大等，故可將MIRI按中醫(yī)“胸痹心痛”進行辨證論治。中醫(yī)學認為MIRI的病機為本虛標實，且兩者可相兼為病，本虛表現(xiàn)為氣血陰陽的虧虛，標實則以血瘀、痰阻、氣滯、寒凝多見，其中醫(yī)辨證分型以氣虛血瘀證最為常見，故可從益氣活血法遣藥組方論治MIRI［17-18］。芪參益氣滴丸作為益氣活血法的代表方劑，可減少PCI術(shù)后心血管事件的發(fā)生率，減輕患者癥狀，提高其活動能力和生活質(zhì)量，并被推薦用于冠狀動脈介入術(shù)后再狹窄、再發(fā)心絞痛和心血管事件的治療以及PCI圍手術(shù)期心肌的保護［19-21］。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，對芪參益氣滴丸改善MIRI的藥效物質(zhì)成分和作用機制進行預(yù)測分析。結(jié)果顯示，芪參益氣滴丸中有125個活性成分分別能與181個藥物-疾病共同靶點發(fā)生相互作用，經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析后共篩選出19個核心作用靶點。同時，利用R程序包對這些核心作用靶點進行GO分析和KEGG分析。富集分析結(jié)果顯示，芪參益氣滴丸通過在核染色質(zhì)、膜筏等部位，調(diào)控DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物過程，發(fā)揮調(diào)節(jié)磷酸酶結(jié)合、MAP激酶活性等分子功能，達到改善MIRI的作用，涉及的信號通路主要包括MAPKs信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-AKT信號通路、mTOR信號通路、TGF-β信號通路、NF-κB信號通路等。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學所構(gòu)建的“中藥-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)顯示，芪參益氣滴丸的不同活性成分可對應(yīng)同一個靶點，同時一個活性成分也可分別對應(yīng)多個靶點，繼而引發(fā)不同的生物學效應(yīng)，這表明芪參益氣滴丸在改善MIRI方面，表現(xiàn)出了多成分、多靶點、多效應(yīng)的特點。分子對接結(jié)果顯示，5個核心作用靶點和8個活性成分，共構(gòu)成了16組對接關(guān)系對，關(guān)系對間親和力良好，對接體系穩(wěn)定。這些結(jié)果提示，芪參益氣滴丸所含的活性成分具有調(diào)控MIRI相關(guān)靶點的生物活性，從側(cè)面佐證了網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測結(jié)果的科學性和可靠性。

研究顯示，芪參益氣滴丸的多種活性成分可通過調(diào)控自噬相關(guān)通路改善MIRI，比如丹參素通過上調(diào)mTOR信號通路對MIRI發(fā)揮保護作用［22］；丹酚酸B防治MIRI的作用機制與PI3K/AKT信號通路調(diào)控的自噬有關(guān)［23］；人參皂苷Rg1通過激活PI3K/AKT/mTOR通 路 上 調(diào)HIF-1α改 善MIRI［24］。MAPKs信號通路介導MIRI病理，而芪參益氣滴丸所含的活性成分黃芪多糖和丹參素，可分別通過下調(diào)p38MAPK信號通路，抑制p-JNK的活性來改善MIRI［25-26］。有研究報道，芪參益氣滴丸的大量活性成分具有抗氧化應(yīng)激的作用，可通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路的表達水平和活性，拮抗MIRI導致的細胞凋亡；還可降低MIRI過程中TNF-α、IL-1β、TLR4、NF-κB等炎性因子的表達［27-28］。此外，芪參益氣滴丸能通過抑制MIRI誘導的TGFβ信號通路的激活，改善其導致的心肌纖維化程度［29］。上述其他學者的研究結(jié)果與本研究所預(yù)測的芪參益氣滴丸改善MIRI作用機制的部分結(jié)果相一致，這充分說明本次研究結(jié)果的可靠性和準確性。

綜上所述，芪參益氣滴丸改善MIRI是多靶點、多途徑的復雜過程，本次研究結(jié)果為進一步探討芪參益氣滴丸改善MIRI的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制提供了可能的研究方向。但由于TCMSP數(shù)據(jù)庫和疾病數(shù)據(jù)庫的不完善以及網(wǎng)絡(luò)藥理學研究自身局限性等因素的影響，本研究結(jié)果尚不能完全闡釋芪參益氣滴丸改善MIRI的生物學基礎(chǔ)，仍需后續(xù)基礎(chǔ)實驗和臨床試驗研究的觀察與佐證。