王慧玲，趙維楠，羅瑞，崔平平，郭瑞霞

1.許昌市第二人民醫(yī)院，河南 許昌 461000；2.許昌市中心醫(yī)院，河南 許昌 461000

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，在常見惡性腫瘤中居第四位，嚴(yán)重危害患者身心健康［1］。近年來，我國宮頸癌病死率明顯增加，同時(shí)患病人群趨向年輕化［2］。目前，臨床上治療宮頸癌主要以手術(shù)為主，配合放療、化療等，但其引起的創(chuàng)傷和不良反應(yīng)較為嚴(yán)重，影響患者的生活質(zhì)量［3］。槲皮素是黃酮類化合物，廣泛存在松針、槐米、菟絲子等植物的葉、花及果實(shí)中，具有較高藥用價(jià)值［4］，有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫抑制、保護(hù)心血管等作用。近年來發(fā)現(xiàn)，槲皮素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖有抑制作用［5-6］。本研究通過觀察槲皮素對(duì)人宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，旨在明確其對(duì)C-33A細(xì)胞的作用機(jī)制，以期為臨床槲皮素藥物的開發(fā)及宮頸癌的有效治療提供理論參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞系人宮頸癌C-33A細(xì)胞（美國ATCC公司，貨號(hào)：YB-ATCC-9284）。

1.2 藥物與試劑槲皮素（含量≥95%，貨號(hào)：Q4951-10G）、噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑（貨號(hào)：M2128-1G）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（貨號(hào)：D5879）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（貨號(hào)：10099-141）、Annexin V-異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：C1062S）、兔抗人蛋白酪氨酸激酶2（janus kinase 2，JAK2）抗體（貨號(hào)：ab108596）、p-JAK2抗體（貨號(hào)：ab219728）、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抗體（貨號(hào)：ab68153）、p-STAT3抗體（貨號(hào)：ab267373）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（貨號(hào)：ab6721）均購自美國Abcam公司。

1.3 儀器TE2000-U型倒置生物顯微鏡（日本Nikon公司）；TY1218型FACSCalibu流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；1658033型垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)取常規(guī)凍存復(fù)蘇的人宮頸癌C-33A細(xì)胞，接種于含10%FBS、100 U·mL-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)。2～3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞藥物處理及分組用DMSO將槲皮素配制成1 mmol·L-1濃度的母液，-20℃保存?zhèn)溆?；?shí)驗(yàn)時(shí)用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋槲皮素母液，使培養(yǎng)基中槲皮素濃度分別為20μmol·L-1、40μmol·L-1、80μmol·L-1，DMSO最終濃度＜0.1%。將對(duì)數(shù)生長期的人宮頸癌C-33A細(xì)胞分為對(duì)照組（DMSO）、20μmol·L-1組（DMSO+20μmol·L-1槲皮素）、40μmol·L-1組（DMSO+40μmol·L-1槲皮素）、80μmol·L-1組（DMSO+80μmol·L-1槲皮素）。

2.3 檢測(cè)細(xì)胞抑制率取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，PBS沖洗，胰酶消化5 min，加入RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為105mL-1，接種于96孔板。細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組、20μmol·L-1組、40μmol·L-1組、80μmol·L-1組更換相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，每孔200μL，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。在各時(shí)間段結(jié)束前4 h按每孔20μL加入5 g·L-1MTT溶液，孵育4 h，每孔加入150μL DMSO，充分震蕩10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm測(cè)定各孔的光密度（A）值，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，計(jì)算抑制率。

抑制率（%）＝（對(duì)照孔A值-用藥孔A值）/對(duì)照孔A值×100%

2.4 檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況取對(duì)數(shù)期細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為106mL-1，接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后，分別更換為相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)48 h。胰酶消化后收集各組細(xì)胞，室溫2 000 r·min-1離心5 min（離心半徑10 cm），棄去上清，加4℃PBS漂洗，加入195μL Binding buffer重懸細(xì)胞，加入5μL AnnexinV-FITC 4℃避光孵育15 min，加入10μL PI染色5 min，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。每組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

2.5 細(xì)胞周期的檢測(cè)將各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，按5×105mL-1接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后，分別更換相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，用胰酶消化后收集各組細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min（離心半徑10 cm），用預(yù)冷PBS漂洗2次后，加入70%預(yù)冷的乙醇，4℃固定過夜，1 000 r·min-1離心5 min（離心半徑10 cm），PBS漂洗2次，用核糖核酸酶消化30 min，用PI染液避光染色30 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。每組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

2.6 檢測(cè)細(xì)胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)密度為106mL-1接種于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞貼壁后各組更換相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，每孔加入蛋白樣品40μL，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，用5%脫脂奶粉孵育1 h，加入1∶1 000稀釋的JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、β-actin一抗，4℃搖床孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入1∶4 000相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，搖床室溫孵育2 h。TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入ECL超敏發(fā)光液，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)顯影、定影，分析條帶結(jié)果。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 槲皮素對(duì)細(xì)胞增殖的影響與20μmol·L-1組比較，40μmol·L-1組、80μmol·L-1組的24 h、48 h、72 h抑制率均升高（P＜0.05），且80μmol·L-1組各時(shí)間抑制率明顯高于40μmol·L-1組（P＜0.05）。20μmol·L-1組、40μmol·L-1組、80μmol·L-1組抑制率均隨時(shí)間延長而增加（P＜0.05）。見表1。

表1 槲皮素對(duì)細(xì)胞增殖的影響 （±s，n＝5，%）

表1 槲皮素對(duì)細(xì)胞增殖的影響 （±s，n＝5，%）

注：與20μmol·L-1組比較，*P＜0.05；與40μmol·L-1組比較，△P＜0.05；與24 h抑制率比較，a P＜0.05；與48 h抑制率比較，b P＜0.05

抑制率20μmol·L-1組 16.52±1.76 33.21±3.64a 42.61±4.57ab組別 24 h抑制率 48 h抑制率 72 h 40μmol·L-1組 27.98±2.94*45.68±4.87*a 53.82±5.61*ab 80μmol·L-1組 35.74±3.75*△54.19±5.68*△a 64.57±6.75*△ab

3.2 細(xì)胞凋亡率比較與對(duì)照組比較，20μmol·L-1組、40μmol·L-1組、80μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率均升高（P＜0.05）；與20μmol·L-1組比較，40μmol·L-1組、80μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率均升高（P＜0.05）；80μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率高于40μmol·L-1組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 槲皮素對(duì)細(xì)胞增殖的影響

3.3 槲皮素對(duì)細(xì)胞周期的影響與對(duì)照組比較，20μmol·L-1組、40μmol·L-1組、80μmol·L-1組G1期細(xì)胞百分率均升高，S期、G2/M期細(xì)胞百分率均降低（P＜0.05）；與20μmol·L-1組比較，40μmol·L-1組、80μmol·L-1組G1期細(xì)胞百分率均升高，S期、G2/M期細(xì)胞百分率均降低（P＜0.05）；80μmol·L-1組G1期細(xì)胞百分率高于40μmol·L-1組，S期、G2/M期細(xì)胞百分率低于40μmol·L-1組（P＜0.05）。見表2，圖2。

表2 槲皮素對(duì)細(xì)胞周期的影響 （±s，n＝5，%）

表2 槲皮素對(duì)細(xì)胞周期的影響 （±s，n＝5，%）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與20μmol·L-1組比較，△P＜0.05；與40μmol·L-1組比較，◇P＜0.05

組別 G1期 S期 G2/M期45.23±5.16 24.37±2.57 29.61±2.84 20μmol·L-1組53.46±5.73* 20.13±2.64* 25.36±2.57*40μmol·L-1組62.51±6.79*△16.49±1.82*△ 20.82±2.03*△80μmol·L-1組73.16±7.35*△◇13.18±1.68*△◇15.47±1.72對(duì)照組*△◇

圖2 槲皮素對(duì)細(xì)胞周期的影響

3.4 槲皮素對(duì)細(xì)胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平的影響與對(duì)照組比較，20μmol·L-1組、40μmol·L-1組、80μmol·L-1組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平明顯降低（P＜0.05）；與20μmol·L-1組比較，40μmol·L-1組、80μmol·L-1組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平均降低（P＜0.05）；80μmol·L-1組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平低于40μmol·L-1組（P＜0.05）。見表3，圖3。

表3 細(xì)胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平比較 （±s，n＝5）

表3 細(xì)胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平比較 （±s，n＝5）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與20μmol·L-1組比較，△P＜0.05；與40μmol·L-1組比較，◇P＜0.05

p-JAK2/JAK2 p-STAT3/STAT3對(duì)照組組別0.92±0.09 0.96±0.10 20μmol·L-1組 0.80±0.07* 0.70±0.07*40μmol·L-1組 0.60±0.05*△ 0.59±0.05*△80μmol·L-1組 0.45±0.04*△◇ 0.51±0.05*△◇

圖3 各組細(xì)胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)

4 討論

宮頸癌嚴(yán)重危害女性身體健康，其病因復(fù)雜，國內(nèi)外流行病學(xué)及實(shí)驗(yàn)研究表明，感染人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是宮頸癌發(fā)病的主要病因，尤其是高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素之一［7-8］。目前宮頸癌的治療手段較多，傳統(tǒng)手術(shù)及放化療方式治療宮頸癌存在較多不良反應(yīng)，長期化療易引起肝腎毒性、神經(jīng)毒性、骨髓抑制等，因此治療宮頸癌應(yīng)合理采用多種治療方式相結(jié)合，對(duì)提高患者的治療效果、改善預(yù)后及減少不良反應(yīng)等有重要意義［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)，多種中藥的活性成分具有抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用［11-13］。臨床上使用中藥治療惡性腫瘤，具有廣闊的應(yīng)用前景。

腫瘤細(xì)胞顯著特點(diǎn)是失控性和無限性，細(xì)胞增殖和凋亡在正常情況下保持著動(dòng)態(tài)平衡，以維持生物自身穩(wěn)定性，細(xì)胞增殖失控或者凋亡受阻都可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［14-15］。細(xì)胞周期是細(xì)胞從上一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束的整個(gè)過程，包括有絲分裂期（M期）和分裂間期（G1期、S期、G2期），細(xì)胞周期阻滯可減慢細(xì)胞增殖速度，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16-17］。體外實(shí)驗(yàn)證明，槲皮素可抑制胰腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抑制作用［18-20］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究顯示，槲皮素可降低結(jié)直腸癌小鼠死亡率［21］。Liu等［22］研究顯示，槲皮素可增加順鉑對(duì)乳腺癌荷瘤小鼠抗腫瘤敏感性，可作為化療佐劑發(fā)揮抗腫瘤作用。另外，槲皮素具有影響腫瘤細(xì)胞周期分布的作用，并可誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞周期阻滯［23-24］。槲皮素具有明顯抗腫瘤活性，但其在宮頸癌中相關(guān)報(bào)道較少。本研究使用不同濃度槲皮素作用于宮頸癌C-33A細(xì)胞，結(jié)果顯示，各濃度槲皮素組較對(duì)照組抑制率、凋亡率及G1期細(xì)胞百分率明顯升高，S期和G2/M期細(xì)胞百分率明顯降低，提示槲皮素可抑制C-33A細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻斷細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)周期阻滯，發(fā)揮抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡及細(xì)胞周期阻滯作用。

JAK2/STAT3通路與細(xì)胞生長、分化和凋亡等過程關(guān)系密切。多種細(xì)胞因子可激活JAK2，JAK2磷酸化后激活下游STAT3活化為p-STAT3，使JAK2/STAT3信號(hào)通路持續(xù)活化，促進(jìn)下游調(diào)控基因過表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞形成、轉(zhuǎn)化、浸潤、遷移等，介導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程［25-26］。研究顯示，STAT3在卵巢癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，阻斷STAT3表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［27-28］。Lu等［29］研究表明，抑制JAK2/STAT3通路，可誘導(dǎo)人食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡。Huang等［30］研究表明，抑制JAK2/STAT3通路可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞G0/G1期阻滯促進(jìn)其凋亡，抑制細(xì)胞侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，各濃度槲皮素組較對(duì)照組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯下降，表明槲皮素可能參與調(diào)控JAK2/STAT3通路的激活。

綜上所述，槲皮素能抑制人宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯，其機(jī)制可能是通過阻斷JAK2/STAT3通路，為臨床槲皮素藥物的開發(fā)及宮頸癌的治療提供一定理論參考。