郭愷，姚新宇，武衛(wèi)靜，王丙乾，栗振中，馬增路

邢臺市人民醫(yī)院，河北 邢臺 054031

急性重癥顱腦損傷（acute severe brain injury，ASBI）是臨床常見急重癥之一，多由交通事故、自然災(zāi)害等外力引起，致殘率及病死率較高［1］。顱腦損傷后機體可出現(xiàn)一系列繼發(fā)性病理活動，其中炎癥因子過度釋放是引起繼發(fā)性腦損傷的重要因素，是影響ASBI預(yù)后的關(guān)鍵因素之一［2］。因此，臨床中不僅注重原發(fā)性顱腦損傷的救治，尋找有效藥物減輕炎癥反應(yīng)引起的繼發(fā)性損傷同樣重要。大黃素是從大黃中提取的蒽醌類化合物，具有抗炎、抑制血小板聚集、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用［3-5］。大黃素可通過抑制急性脊髓損傷后炎癥反應(yīng)而減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷［6］。目前，關(guān)于大黃素對ASBI炎癥反應(yīng)的抑制作用研究尚少，本研究通過觀察大黃素對ASBI模型大鼠炎癥反應(yīng)的作用，探討大黃素對ASBI炎癥抑制的可能機制，為臨床中ASBI的治療提供參考。

1 材料

1.1 動物SPF級雄性SD大鼠50只，7周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自南京生物醫(yī)藥研究院，許可證號：SCXK（蘇）2018-0001，飼養(yǎng)于邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?？蒲兄行?，飼養(yǎng)于12 h/12 h明暗交替、溫度20～26℃、濕度50%～70%的環(huán)境下，倫理批號：20191215。

1.2 藥品與試劑大黃素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號：1071101109）。血清可溶性鈣結(jié)合蛋白（soluble calcium binding protein，S100B）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（美國R＆D公司，貨號分別為：AF1820-SP、S6050、210-TA-020/CF）；SYBR Premix Ex Taq II試劑盒（日本TAKARA公司，貨號：RR820A）；兔抗大鼠核因子（nuclear factor，NF）-κB p65、磷酸化NF-κB p65（phosphorylated-p-NF-κB p65，pNF-κB p65）、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、核因子E2相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）單抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（美國Abcam公司，貨號分別為：ab207297、ab183559、ab215033、ab76026、ab207086）。

1.3 儀器7500型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；PowerPro3AMP型電泳儀（英國Cleaver公司）；CheniDoc XRS型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 模型復(fù)制、動物分組及給藥方法選取50只大鼠，按體質(zhì)量隨機分組：假手術(shù)組、模型組、大黃素低劑量組（10 mg·kg-1）、大黃素中劑量組（20 mg·kg-1）和大黃素高劑量組（40 mg·kg-1），各10只；除假手術(shù)組外，其余4組采用自由落體法建立ASBI模型；采用自由落體法建立ASBI模型［7］：0.35%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，顱頂消毒、脫毛，俯臥固定頭部，顱頂切開皮膚暴露頂骨，標(biāo)記冠狀縫左3 mm、中線旁3 mm位置，用牙科鉆鉆一直徑3 mm骨窗，顯露硬膜；下端直徑2.0 mm打擊器以速度4 m·s-1自由落體打擊硬膜，控制打擊深度2.5 mm，造成左側(cè)顱腦損傷，局部止血后縫合皮膚，消毒。大鼠清醒后采用神經(jīng)功能缺損評分（neurological severity scores，NSS）評估，NSS≥13分則ASBI大鼠建模成功，NSS＜13分或術(shù)后1 d內(nèi)死亡則建模失敗，建模成功的大鼠單籠飼養(yǎng)，參與后續(xù)實驗。于建模成功后1 d，各組給予相應(yīng)的藥物，假手術(shù)組和模型組注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。

2.2 相關(guān)指標(biāo)的檢測

2.2.1 術(shù)后神經(jīng)功能評估所有大鼠采用NSS評估給藥第1、3、7天時大鼠神經(jīng)功能，均于給藥后2 h評估，量表從行走、平衡、反射、提尾、感覺5個方面對大鼠神經(jīng)功能進行評估，分別評分3分、6分、4分、3分、2分，總分0～18分，分?jǐn)?shù)越高神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重，其中總分≥13分為重度顱腦損傷。

2.2.2 對ASBI模型大鼠血清S100B、IL-6、TNF-α水平的影響所有大鼠末次給藥后眼眶靜脈叢采血，靜置分層后，以離心半徑為12 cm、3 500 r·min-1離心5 min，取上層血清，用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測血清S100B、IL-6、TNF-α水平［8］。

2.2.3 HE染色觀察腦組織病理學(xué)變化采血后脫頸處死各組大鼠，每組取4只大鼠的左側(cè)腦組織，置于40 ng·L-1多聚甲醛中固定48 h，經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋后，制作厚度為4μm的連續(xù)切片，進行常規(guī)HE染色，中性樹膠封片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理學(xué)改變［9］。

2.2.4 RT-qPCR法檢測腦組織中NF-κB p65mRNA、ICAM-1mRNA、Nrf2mRNA水平采血后脫頸處死各組大鼠，每組隨機取4只大鼠的左側(cè)腦組織，分為兩部分，一部分用于RT-qPCR實驗，另一部分用于Western Blot實驗。用Trizol法提取腦組織中總核糖核酸，采用瓊脂糖凝膠試驗鑒定樣本完整性，然后反轉(zhuǎn)錄獲得互補鏈DNA（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），將其作為模板鏈進行RT-qPCR，反應(yīng)體系按照SYBR Premix Ex Taq II試劑盒說明書設(shè)定，反應(yīng)條件為94℃3 min；94℃30 s，57℃45 s，72℃90 s，共40個循環(huán)，以β-肌動蛋白（β-actin）作為內(nèi)參對照，計算NF-κB p65 mRNA、ICAM-1 mRNA、Nrf2 mRNA水平（計算公式為2-△△CT）［10］。引物序列：NF-κB p65：F：5′-ATGCTGATGTCGATGCTATG-3′，R：5′-ATGCTGAAACTGCTCATGCG-3′；ICAM-1：F：5′-CCCTGACTGCAACTTGCCA-3′，R：5′-TGATGCTTTGAACTGTGAC-3′；Nrf2：F：5′-TAGCCCTGATGATGCTGATC-3′，R：5′-CTGATGCCTGAATGTGATCG-3′；β-actin：F：5′-CTGATGTACAAATGTCTA-3′，R：5′-CTGATGCTGATGCCAGTA-3′。

2.2.5 Western Blot法檢測腦組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65、ICAM-1、Nrf2蛋白表達取上述各組大鼠左側(cè)腦組織的另一部分，加入液氮研磨，轉(zhuǎn)至離心管，然后加入細(xì)胞裂解液于冰上充分裂解30 min，4℃、離心半徑10 cm、12 000 r·min-1離心10 min，取上清測定蛋白濃度并變性，然后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加一抗、二抗、曝光和顯影，Image J軟件進行分析，蛋白相對表達量用NF-κB p65、p-NFκB p65、ICAM-1、Nrf2與β-actin灰度值比值表示［11］。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，重復(fù)計量資料比較采用重復(fù)測量方差分析，兩樣本比較采用LSD-t檢驗，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般情況40只大鼠共34只建模成功，其中4只術(shù)后1 d內(nèi)死亡，2只NSS評分低于13分建模不成功，建模成功率為85%，其中模型組、大黃素低劑量組、大黃素中劑量組和大黃素高劑量組分別有8只、8只、9只、9只建模成功。術(shù)后干預(yù)期間，假手術(shù)組大鼠步態(tài)、精神、飲食等一般狀態(tài)逐漸恢復(fù)正常，模型組大鼠神經(jīng)功能持續(xù)缺損或加重，精神、飲食等狀態(tài)不佳，毛色暗淡無光澤，喜臥；大黃素各劑量組上述一般狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)好。

3.2 對ASBI模型大鼠NSS的影響與假手術(shù)組比較，模型組NSS均升高（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素低劑量組術(shù)后第7天及大黃素中、高劑量組術(shù)后第3天、第7天NSS均明顯降低（P＜0.05）；與術(shù)后第1天比較，大黃素低、中、高劑量組術(shù)后第3天、第7天NSS均明顯降低（P＜0.05）；與術(shù)后第3天比較，大黃素低、中、高劑量組術(shù)后第7天NSS均明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 對ASBI模型大鼠NSS的影響 （±s，分）

表1 對ASBI模型大鼠NSS的影響 （±s，分）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與術(shù)后第1天比較，△P＜0.05；與術(shù)后第3天比較，＆P＜0.05

組別 n 術(shù)后第1天 術(shù)后第3天 術(shù)后第7天10 2.54±0.20 1.77±0.35 1.50±0.27模型組 8 13.81±1.51＃ 12.92±1.46＃ 12.45±1.28＃大黃素低劑量組 8 13.73±1.45 12.28±1.04△ 11.10±1.10*△大黃素中劑量組 9 13.60±1.52 11.24±1.07*△ 9.54±0.81*△大黃素高劑量組 9 13.57±1.50 9.23±0.84*△ 7.21±0.74*△假手術(shù)組

3.3 對ASBI模型大鼠血清S100B、IL-6、TNFα水平的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清S100B、IL-6、TNF-α水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素低、中、高劑量組血清S100B、IL-6、TNF-α水平均明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 對ASBI模型大鼠血清S100B、IL-6、TNF-α水平的影響 （±s，μg·L-1）

表2 對ASBI模型大鼠血清S100B、IL-6、TNF-α水平的影響 （±s，μg·L-1）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別 n S100B IL-6 TNFα 10 3.14±0.95 30.55±4.87 3.54±0.92模型組 8 26.95±2.47＃ 68.90±6.01＃ 8.52±1.23＃大黃素低劑量組 8 20.11±2.11* 59.26±6.42* 7.03±1.20*大黃素中劑量組 9 15.34±1.98* 51.03±5.74* 5.81±1.01*大黃素高劑量組 9 10.89±1.23* 44.51±5.11* 4.47±0.90假手術(shù)組*

3.4 觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核正常無腫脹；模型組大鼠病灶局限于腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)，損傷側(cè)大量神經(jīng)元壞死、膠質(zhì)細(xì)胞增生、大量中性粒細(xì)胞浸潤；大黃素各劑量組大鼠腦組織上述病理學(xué)改變較ASBI減輕，但仍存在神經(jīng)元壞死、中性粒細(xì)胞浸潤、組織空洞、細(xì)胞水腫等，其中大黃素高劑量組病變減輕最為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)變化（HE，×100）

3.5 對ASBI模型大鼠腦組織中NF-κB p65mRNA、ICAM-1mRNA、Nrf2mRNA表達的影響與假手術(shù)組比較，模型組NF-κB p65 mRNA、ICAM-1 mRNA水平升高，Nrf2 mRNA水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素低、中、高劑量組ICAM-1 mRNA水平降低，Nrf2 mRNA水平明顯升高（P＜0.05）；大黃素中、高劑量組大鼠腦組織NF-κB p65 mRNA水平明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表3 對ASBI模型大鼠腦組織中NF-κB p65 mRNA、ICAM-1 mRNA、Nrf2 mRNA表達的影響（±s）

表3 對ASBI模型大鼠腦組織中NF-κB p65 mRNA、ICAM-1 mRNA、Nrf2 mRNA表達的影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

mRNA假手術(shù)組組別 n NF-κB p65 mRNA ICAM-1 mRNA Nrf2 4 0.95±0.10 0.55±0.10 1.04±0.09模型組 4 1.03±0.13＃ 3.21±0.28＃0.25±0.04＃大黃素低劑量組4 1.01±0.15 2.84±0.24*0.50±0.06*大黃素中劑量組4 0.98±0.12* 2.13±0.20*0.61±0.07*大黃素高劑量組4 0.96±0.11* 1.42±0.19*0.73±0.08*

3.6 對ASBI模型大鼠腦組織中ICAM-1、Nrf2及p-NF-κB p65蛋白表達的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織ICAM-1、p-NF-κB p65蛋白表達明顯升高，Nrf2蛋白相對表達降低（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素低、中、高劑量組大鼠腦組織ICAM-1、p-NF-κB p65蛋白表達明顯降低（P＜0.05），Nrf2蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見表4，圖2。

表4 對ASBI模型大鼠腦組織中ICAM-1、Nrf2及p-NF-κB p65蛋白表達的影響 （±s）

表4 對ASBI模型大鼠腦組織中ICAM-1、Nrf2及p-NF-κB p65蛋白表達的影響 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別 n p-NF-κBp65/NF-κBp65 ICAM-1/β-actin Nrf2/β-actin 4 0.15±0.04 0.30±0.05 1.41±0.13模型組 4 0.97±0.08＃ 1.56±0.12＃ 0.13±0.04＃大黃素低劑量組 4 0.85±0.09* 1.22±0.10* 0.51±0.05*大黃素中劑量組 4 0.72±0.10* 1.03±0.09* 0.82±0.08*大黃素高劑量組 4 0.40±0.08* 0.77±0.08* 1.10±0.09假手術(shù)組*

圖2 各組大鼠腦組織中NF-κB p65、ICAM-1、Nrf2蛋白表達圖

4 討論

ASBI病情危重，是臨床病死率排名第一的創(chuàng)傷性疾病，隨著交通運輸業(yè)的發(fā)展，ASBI發(fā)生率逐年升高［12］。雖然醫(yī)療技術(shù)不斷提高，ASBI搶救成功率提高，但存活患者多伴隨嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙，給患者及家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)［13-14］。研究表明，ASBI繼發(fā)性腦損傷是導(dǎo)致患者死亡的重要原因，其發(fā)病機制十分復(fù)雜。研究認(rèn)為，其發(fā)病機制主要為腦組織內(nèi)過度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡、功能喪失［15-17］。因此，選取有效藥物抑制ASBI后過度炎癥反應(yīng)對改善患者預(yù)后有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組NSS、血清S100B、IL-6、TNF-α水平高于假手術(shù)組，提示建模成功后大鼠神經(jīng)功能受損嚴(yán)重，機體存在炎癥反應(yīng)。S100B是由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的一種鈣結(jié)合蛋白，生理狀態(tài)下可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鈣離子平衡而參與細(xì)胞能量代謝，過度分泌可刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎因子，如IL-6、TNF-α，從而加劇腦組織炎癥反應(yīng)［18-19］。研究顯示，顱腦損傷后血清S100B、IL-6水平明顯升高且與腦損傷程度關(guān)系密切［20-21］。王琛等［22］研究表明，大黃素對慢性壓迫性損傷大鼠脊髓損傷側(cè)促炎細(xì)胞因子有明顯抑制作用；且多項研究均證實大黃素具有顯著抗炎作用［23-24］，與本研究結(jié)果相似。本研究用不同劑量大黃素干預(yù)后，NSS、血清S100B、IL-6、TNF-α水平均較ASBI組有所降低，且呈劑量依賴性，說明大黃素可通過抑制ASBI大鼠機體炎癥反應(yīng)而改善神經(jīng)功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，ASBI組腦組織中ICAM-1 mRNA和蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65均高于假手術(shù)組，Nrf2 mRNA和其蛋白表達低于假手術(shù)組，說明ASBI發(fā)生發(fā)展過程中NF-κB p65磷酸化水平升高、ICAM-1表達激活，而Nrf2表達被抑制。NF-κB是調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)的重要信號分子，ICAM-1是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的黏附分子，腦損傷后其水平迅速升高，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［25-26］。腦損傷引起血漿中的NF-κB p65蛋白轉(zhuǎn)至細(xì)胞核而被激活，通過炎癥因子IL-6、TNF-α促進ICAM-1表達上調(diào)。有研究表明，NF-κB可與ICAM-1啟動子結(jié)合進而促進ICAM-1表達［27-29］。Nrf2是介導(dǎo)氧化應(yīng)激因子表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，研究表明，NF-κB信號通路下游蛋白p65可負(fù)調(diào)控Nrf2蛋白，從而活化炎癥及氧化應(yīng)激多個下游事件，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)進程［30-31］。本研究應(yīng)用不同劑量大黃素干預(yù)后，大鼠腦組織ICAM-1 mRNA及p-NF-κB p65/NF-κB p65水平降低，Nrf2 mRNA水平升高，ICAM蛋白表達下調(diào)，Nrf2蛋白表達上調(diào)，提示大黃素可抑制NF-κB p65磷酸化及下游ICAM-1表達，而p-NF-κB p65的抑制使Nrf2負(fù)調(diào)控激活，最終發(fā)揮抑制ASBI大鼠炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，大黃素可有效抑制ASBI大鼠炎癥反應(yīng)，推測可能通過NF-κB/Nrf2通路發(fā)揮調(diào)控作用，為臨床中大黃素相關(guān)藥物的研發(fā)及應(yīng)用與ASBI患者的治療提供理論支持。