李曉娟，唐彥武，李柱剛，王珣*，趙曦，冷春旭，陸杰

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，哈爾濱 150028；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所，哈爾濱 150028；4.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院齊齊哈爾分院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；5.黑龍江省南瓜育種與深加工工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150028)

果膠是一類存在于多種植物中的多聚糖類化合物，D-半乳糖醛酸為其主要組成部分[1-2]。果膠綠色天然、無毒環(huán)保的特點(diǎn)使其在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用日趨普遍[3-4]。果膠是一種常見的食品添加劑，主要功能是作為乳化劑、穩(wěn)定劑、凝膠劑和增稠劑等改善食品和調(diào)味制品的外觀、組織、口感以及生物利用度等[5-7]。果膠在日常飲食中隨處可見，在調(diào)味制品(果醬、醬料等)、烘焙產(chǎn)品(面包、糕點(diǎn)等)、飲品(酸奶、乳酸飲料等)和休閑食品(果凍、軟糖等)中都有廣泛的應(yīng)用[8]。有學(xué)者從甜菜、檸檬、山竹、柑橘、木瓜等植物殘?jiān)刑崛」z，但隨著果膠在食品領(lǐng)域的需求增加，尚需要從國外進(jìn)口[9-13]。籽用南瓜果肉資源，在取食南瓜籽后常作為飼料或被廢棄，可作為開發(fā)新型果膠的原料[14-17]。研究證實(shí)，南瓜果膠具有明顯的抗氧化，吸附重金屬保護(hù)細(xì)胞等功效[18]。

目前果膠的提取方法很多，但果膠提取中往往伴隨蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，蛋白質(zhì)的存在不僅影響果膠的純度和結(jié)構(gòu)，甚至可能影響果膠的生物活性，因而蛋白質(zhì)的脫除是果膠純化的關(guān)鍵步驟[19-22]。目前常用的脫蛋白工藝有Sevag法、TCA法、酶法和鹽析法等，與單一方法相比，聯(lián)合工藝效果更好[23]，課題組前期通過比較Sevag法和TCA法，確定TCA法更適合南瓜果膠脫蛋白。綜上所述，本文以籽用南瓜果肉為原料，分離南瓜粗果膠，將酶法與TCA法相結(jié)合的ETCA法應(yīng)用于粗果膠脫蛋白工藝的研究，并對脫蛋白前后果膠樣品的抗氧化活性進(jìn)行檢測，考察南瓜果膠作為食品添加劑的可行性，為南瓜果膠功能食品的研發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜品種為“金龍瓜1號”：2018年10月采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所園區(qū)，采收后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室當(dāng)天處理；所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 南瓜粗果膠的分離

南瓜去籽、洗凈、切塊，滅酶，烘干破碎，得到南瓜粉(60目)。精確稱取適量南瓜粉，按1∶30(m/V)加入蒸餾水，放入超聲儀中，80 ℃提取1 h。將提取液真空濃縮至原來的1∶4(V/V)，溫度降至常溫后，放入4倍體積95%乙醇，過濾所得固形物冷凍干燥待測。

1.2.2 果膠脫蛋白率測定[24]

以考馬斯亮藍(lán)G-250為染料液，預(yù)制濃度為0.1 mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)母液，分別取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL母液放入具塞試管中，加水定容1 mL，分別放入定容后5倍體積染料液，搖勻后，反應(yīng)5 min。以蒸餾水作為空白對照，測定595 nm處各樣品的吸光度。y=0.006821x+0.03308，R2=0.9972(y為吸光值，x為BSA含量)。

取一定濃度樣品溶液1 mL，替代BSA，后續(xù)按上述方法進(jìn)行，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

果膠脫蛋白率按公式(1)計(jì)算：

脫蛋白率/%=(C前-C后)/C前×100。

公式(1)

式中：C前為脫蛋白前蛋白含量(μg/mL)；C后為脫蛋白后蛋白含量(μg/mL)。

1.2.3 果膠留存率測定[25]

將0.1 mg/mL半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液配制成濃度為10，20，30，40，50，60，70，80 μg/mL的梯度標(biāo)準(zhǔn)液，加入6 mL濃硫酸，緩慢振蕩，靜置電熱恒溫水槽中90 ℃，15 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫。加入1.5 mg/mL咔唑無水乙醇0.2 mL，混合均勻，避光反應(yīng)2 h。以1 mL蒸餾水替代標(biāo)準(zhǔn)液作為空白，按相同步驟操作，檢測530 nm波長下各樣品的吸光值。y=0.006963x+0.003286，R2=0.9983(y為吸光值，x為半乳糖醛酸含量)。

取一定濃度樣品1 mL，替代半乳糖醛酸，后續(xù)按上述方法進(jìn)行，計(jì)算半乳糖醛酸含量。

果膠留存率按公式(2)計(jì)算：

果膠留存率/%=M后/M前×100。

公式(2)

式中：M前為脫蛋白前果膠含量(μg/mL)；M后為脫蛋白后果膠含量(μg/mL)。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 酶用量

精確量取40 mg/mL南瓜果膠樣液40 mL，分別加入0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%(W/V)的木瓜蛋白酶，將樣品置于50 ℃電熱恒溫水槽2 h，再于100 ℃ 10 min使酶失活，待樣品溫度下降至常溫，加4% TCA 20 mL，混勻，劇烈振蕩30 min后靜置，20 min后離心(4000 r/min，10 min)，取出上層溶液稀釋至一定濃度后，檢測果膠和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算果膠脫蛋白率和留存率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.2 酶解溫度

精確量取40 mg/mL南瓜果膠樣液40 mL，加入0.5%(W/V)的酶，分別置于35，40，45，50，55 ℃電熱水槽2 h，此后沸水滅酶10 min，待反應(yīng)液溫度下降至常溫，加入4% TCA 20 mL，強(qiáng)力振蕩30 min，放置20 min離心(4000 r/min，10 min)，取出上層溶液稀釋至一定濃度后，以硫酸咔唑法檢測果膠含量，Bradford法檢測蛋白質(zhì)含量，計(jì)算果膠脫蛋白率和留存率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.3 酶解時(shí)間

精確量取40 mg/mL南瓜果膠樣液40 mL，加入0.5%(W/V)的酶，置于50 ℃電熱恒溫水槽0.5，1，1.5，2，2.5 h，此后沸水滅酶10 min，待樣品溫度下降至常溫，加入4% TCA溶液 20 mL，強(qiáng)力振蕩30 min，放置20 min離心(4000 r/min，10 min)，取出上層溶液稀釋至一定濃度后，檢測果膠和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算果膠脫蛋白率和留存率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取酶用量、酶解溫度和酶解時(shí)間3個(gè)變量，結(jié)合1.2.4的試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(34)試驗(yàn)優(yōu)化ETCA法，采用綜合加權(quán)平均法進(jìn)行評分，其因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.6 透析

將脫蛋白后樣品裝入預(yù)先處理好的透析袋內(nèi)，先后采用流水和蒸餾水透析48 h和24 h，期間換3次蒸餾水。取出透析果膠溶液，濃縮至1/4體積，待溫度降至常溫，放入4倍量無水乙醇并不斷攪拌，放置1 h，過濾，45 ℃烘干，獲得脫蛋白南瓜果膠樣品。

1.2.7 羥基自由基(·OH)清除能力測定[26]

不同濃度0.625，1.25，2.5，5，10，20 mg/mL脫蛋白前后南瓜果膠液各取1 mL，依次分別加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL、9 mmol/L FeSO4溶液1 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL，混勻。放入37 ℃電熱恒溫水槽中水浴15 min，取出，冷卻至室溫。以VC作為陽性對照，檢測510 nm波長處各溶液的吸光度，試驗(yàn)重復(fù)3次。清除率計(jì)算公式如下：

羥自由基清除率/%=[A空白-(A樣品-A對照)]/A空白×100。

公式(3)

式中：A空白為空白對照吸光值，A樣品為樣品吸光值，A對照為不加顯色劑H2O2。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶用量對脫蛋白作用的影響

采用ETCA法對南瓜果膠脫蛋白，探討酶用量(0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%，W/V)對果膠脫蛋白作用的影響。

圖1 酶用量對脫蛋白作用的影響Fig.1 The effect of additive amount of enzyme on deproteinization

由圖1可知，伴隨酶用量的增多，脫蛋白率快速上升而后趨于平穩(wěn)。原因可能是當(dāng)酶用量在0.1%～0.5%時(shí)，底物與木瓜蛋白酶接觸面積會(huì)隨酶用量的增多而增長，表現(xiàn)為果膠脫蛋白率快速上升；當(dāng)酶用量超過0.5%時(shí)，蛋白脫除率變化不顯著，可能是由于有限的底物限制了木瓜蛋白酶進(jìn)一步反應(yīng)。隨著酶的增多，果膠留存量持續(xù)下降，當(dāng)酶用量超過0.5%時(shí)，果膠含量下降速度由慢變快，可能是由于在大量酶的作用下，蛋白迅速發(fā)生水解，某些果膠也改變了構(gòu)象，與蛋白一同被分離出來。綜合考慮果膠留存率和脫蛋白率選擇0.4%～0.6%作為正交試驗(yàn)酶用量的水平范圍。

2.1.2 酶解溫度對脫蛋白作用的影響

采用酶聯(lián)合三氯乙酸法對南瓜果膠進(jìn)行脫蛋白，探討酶解溫度(35，40，45，50，55 ℃)對果膠脫蛋白作用的影響。

圖2 酶解溫度對脫蛋白作用的影響Fig.2 The effect of enzymolysis temperature on deproteinization

由圖2可知，當(dāng)溫度范圍處于35～50 ℃之間，果膠脫蛋白率呈現(xiàn)不斷上升趨勢，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，果膠脫蛋白效果最好，高出50 ℃后，果膠脫蛋白率稍有下滑趨勢，大概與酶作用在最適溫度時(shí)酶活力達(dá)到最大有關(guān)，高于最適溫度，酶活力開始降低，過高溫度會(huì)導(dǎo)致木瓜蛋白酶不能充分發(fā)揮作用。果膠留存率受酶解溫度的影響不大，綜合考慮果膠留存率和脫蛋白率，選擇45～55 ℃作為正交試驗(yàn)酶解溫度的水平范圍。

2.1.3 酶解時(shí)間對脫蛋白作用的影響

采用ETCA法對南瓜果膠脫蛋白，探討酶解時(shí)間(0.5，1，1.5，2，2.5 h)對果膠脫蛋白作用的影響。

圖3 酶解時(shí)間對脫蛋白作用的影響Fig.3 The effect of enzymolysis time on deproteinization

由圖3可知，在0.5～2 h時(shí)，隨著時(shí)間的增長，果膠脫蛋白率不斷增加，果膠留存率緩慢下降。分析原因可能是酶解時(shí)間較短時(shí)，酶不能與底物充分接觸，果膠中蛋白質(zhì)溶出緩慢。當(dāng)酶解時(shí)間超過2 h時(shí)，果膠脫蛋白率基本保持不變，果膠留存率持續(xù)降低，可能是由于此時(shí)蛋白脫除過程基本完成，進(jìn)一步延長時(shí)間反而導(dǎo)致果膠開始降解，綜合考慮果膠留存率和脫蛋白率，選擇1.5～2.5 h作為正交試驗(yàn)酶解時(shí)間的水平范圍。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)中選取的3個(gè)因素對果膠脫蛋白都有一定作用。通過1.2.4選取范圍進(jìn)行正交試驗(yàn)以獲得果膠脫蛋白最優(yōu)工藝，以綜合評價(jià)率為指標(biāo)，分析脫蛋白作用。

表2 正交試驗(yàn)直觀分析表Table 2 The orthogonal experiment intuitive analysis table

續(xù) 表

表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 The analysis of variance table of orthogonal test

由表2可知，3個(gè)因素中，酶用量的極差(R)最大，酶解溫度的極差最小，因而對果膠脫蛋白作用影響從大到小依次是A>C>B。由均值(K)可知，果膠脫蛋白各參數(shù)的最優(yōu)水平為A2B2C1。由表3可知，方差分析結(jié)果與直觀分析結(jié)果相吻合，其中酶用量對果膠脫蛋白所起作用最顯著。因此，南瓜果膠的ETCA法脫蛋白最優(yōu)參數(shù)為：酶用量0.5%，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間1.5 h。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)所得脫蛋白最佳工藝條件，選擇ETCA法對南瓜果膠脫蛋白，試驗(yàn)重復(fù)3次。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of verification experiment

由表4可知，脫蛋白率為83.28%，果膠存留率為76.40%，表明ETCA法優(yōu)化出的南瓜果膠脫蛋白參數(shù)可行。

2.4 抗氧化活性結(jié)果

羥基自由基(·OH)是最活躍的自由基，差不多所有活細(xì)胞中與生命有關(guān)的大分子都可以與此自由基產(chǎn)生作用而造成氧化性損傷，使組織細(xì)胞病變，進(jìn)而加速機(jī)體的衰老。因此，尋求合適的物質(zhì)消除這一自由基尤為關(guān)鍵。本試驗(yàn)采用不同濃度(0.625，1.25，2.5，5，10，20 mg/mL)脫蛋白前后南瓜果膠樣品溶液作為清除劑，進(jìn)而評價(jià)自由基清除活性。

圖4 羥基自由基(·OH)試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The hydroxyl radical scavenging ability test results

由圖4可知，南瓜果膠溶液濃度在一定范圍內(nèi)，隨著果膠濃度的增加，對羥基自由基(·OH)的清除作用越來越明顯，而后趨于平穩(wěn)狀態(tài)，結(jié)果顯示南瓜果膠有一定的抗氧化作用。相同濃度VC溶液和脫蛋白前后樣品清除·OH自由基作用對比結(jié)果：VC>脫蛋白后果膠>脫蛋白前果膠。當(dāng)樣品濃度為20 mg/mL時(shí)，脫蛋白后樣品清除率為67.18%±2.59%，脫蛋白前樣品清除率為47.87%±1.91%，脫蛋白后果膠樣品抗氧化效果更好。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以脫蛋白率和果膠存留率為指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)方法研究了不同影響因素對ETCA法脫蛋白作用的影響，以綜合加權(quán)平均法計(jì)算綜合評價(jià)率，運(yùn)用正交試驗(yàn)并優(yōu)化了ETCA法的除蛋白過程，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明過程參數(shù)切實(shí)可行。在一定濃度范圍內(nèi)，羥基自由基清除試驗(yàn)證明南瓜果膠具有良好的抗氧化活性。本研究結(jié)果可為南瓜果膠工業(yè)開發(fā)提供技術(shù)支持，從而使南瓜果膠更有效地應(yīng)用和服務(wù)于食品與調(diào)味品行業(yè)，同時(shí)推動(dòng)南瓜資源的進(jìn)一步開發(fā)利用。