杜英立，吳翠蘭，陸 震，藍(lán)金紅★，曾令越，龍愛淑，李 軍★，彭 昊

（1.馬山縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 530600；2. 廣西獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 530001；3. 馬山縣百龍灘鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)林業(yè)和水利站 530618；4. 三江侗族自治縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 545500）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是一種人畜共患的革蘭氏陰性菌[1]，正常存在于動(dòng)物的上呼吸道，宿主動(dòng)物在先天免疫應(yīng)答受損時(shí)(如病毒感染、免疫抑制、應(yīng)激等)，多殺性巴氏桿菌能夠突破扁桃體等機(jī)體防御屏障，進(jìn)入下呼吸道，引起呼吸道疾病和全身感染，臨床可見于豬、牛、羊、兔的肺炎，牛和水牛的急性敗血癥，豬的萎縮性鼻炎和家禽的禽霍亂[2，3]。多殺性巴氏桿菌是引起牛呼吸道疾病綜合征的主要病原，病牛表現(xiàn)為咳嗽、喘，精神沉郁、食欲減退、消瘦、呼吸困難等癥狀。時(shí)至今日，該病的發(fā)生并未減退，為此，本研究擬對(duì)某例病死牛進(jìn)行病原分離、PCR擴(kuò)增鑒定和鑒型，并進(jìn)行藥物敏感性、致病性試驗(yàn)，為其防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胰蛋白胨大豆瓊脂平板培養(yǎng)基、胰蛋白大豆肉湯購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、2×ES Taq MasterMix等均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR儀、凝膠成像儀購(gòu)自Biorad公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

體重為18～22 g的10只健康小鼠，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 引物設(shè)計(jì)

按吳翠蘭等方法[4]合成多殺性巴氏桿菌（Pm）、A（B/D/E/F）型多殺性巴氏桿菌（Pm-A、Pm-B、Pm-D、Pm-E、Pm-F）的引物，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.4 病原的分離鑒定

無菌采取牛肺臟在胰蛋白胨大豆瓊脂平板培養(yǎng)基上進(jìn)行接種，37℃培養(yǎng)24h后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，再挑取純化后的菌落進(jìn)行生化鑒定和PCR擴(kuò)增鑒定。

1.5 致病性試驗(yàn)

取10只小白鼠隨機(jī)分為2組，每組各5只。試驗(yàn)組小鼠的攻毒劑量為0.3 mL/只，對(duì)照組則注射等量的生理鹽水，同等條件下培養(yǎng)，每天觀察小鼠狀況。

1.6 藥物敏感性試驗(yàn)

采用NCCLS[5]推薦的K-B紙片法，選用阿米卡星、卡那霉素、諾氟沙星等12種抗菌藥物進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)。當(dāng)抑菌圈直徑≥15 mm，判斷為高敏；15mm＞抑菌圈直徑＞10 mm，判斷為中敏；抑菌圈直徑＜10 mm，判斷為耐藥。

2 結(jié)果

2.1 病原的分離鑒定

病料接種于胰蛋白胨大豆瓊脂平板培養(yǎng)基生長(zhǎng)有圓形小菌落。將分離到的菌接種于生化鑒定管，37℃培養(yǎng)24 ～48 h后，該菌能不分解肝糖和乳糖，能分解葡萄糖、吲哚試驗(yàn)為陽(yáng)性，該生化反應(yīng)結(jié)果與符合多殺性巴氏桿菌的生化特性。以該菌DNA為模板分別進(jìn)行多殺性巴氏桿菌和多殺性巴氏桿菌不同血清型基因的PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果顯示能擴(kuò)出456 bp和1048 bp的特異性條帶（圖1），表明在該菌為A型多殺性巴氏桿菌。

圖1 PCR擴(kuò)增

2.2 致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠接種24 h內(nèi)全部死亡，而對(duì)照組小鼠未見異常。采集死亡小鼠的肺臟等臟器進(jìn)行分菌，可從死亡小鼠肺中成功分離到A型多殺巴氏桿菌，由此可知，該分離株具有很強(qiáng)的致病性。

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)共用12種藥物對(duì)分離到的菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，其結(jié)果見表2。分離菌對(duì)阿米卡星、卡那霉素、諾氟沙星高敏；對(duì)氟苯尼考、丁胺卡那、頭孢曲松、慶大霉素、四環(huán)素中敏；對(duì)鏈霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、青霉素耐藥。

表2 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

多殺性巴氏桿菌可在許多動(dòng)物和人類中引起急性或慢性感染。近年來，隨著廣西養(yǎng)牛業(yè)的蓬勃發(fā)展，牛只調(diào)運(yùn)頻繁，牛巴氏桿菌病的流行和發(fā)生逐漸增多。本研究從病死牛的肺臟中分離到1株具有致病性的A型多殺巴氏桿菌，對(duì)阿米卡星和卡那霉素高敏，對(duì)鏈霉素、紅霉素和環(huán)丙沙星耐藥。

根據(jù)莢膜抗原，可將多殺巴氏桿菌分為5個(gè)血清型，分別為A型、B型、D型、E型和F型，其中A型和B型的毒力最強(qiáng)，感染動(dòng)物的死亡率較高[6]。B型是中國(guó)牛群以前最流行的莢膜血清型，但近幾年來，我國(guó)頻頻報(bào)道從病死牛中分離到A型多殺巴氏桿菌[6-9]。牛A型多殺巴氏桿菌病的流行可能是由于目前巴氏桿菌疫苗主要是針對(duì)B型，而對(duì)A型的保護(hù)率差，因此，A型多殺巴氏桿菌疫苗的研究成為熱點(diǎn)。朱玲[10]、賀奮義[11]、嵇少澤[12]等均已對(duì)A型多殺巴氏桿菌候選疫苗的篩選做了相關(guān)性的研究。本研究分離到1株A型多殺巴氏桿菌，為A型疫苗的研制提供實(shí)驗(yàn)材料。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，A型多殺巴氏桿菌存在廣泛的耐藥性。以往青霉素和鏈霉素是治療多殺巴氏桿菌病的首選藥物，通過本次結(jié)果來看，該菌均對(duì)青鏈霉素耐藥。耐藥菌株的出現(xiàn)，究其原因是藥物的不合理使用、耐藥基因的傳代等[13]。鑒于多重耐藥株的出現(xiàn)，現(xiàn)在研究著把研究瞄點(diǎn)轉(zhuǎn)向微生態(tài)制劑的研究。微生態(tài)制劑可調(diào)節(jié)微生態(tài)失調(diào)，保持生態(tài)平衡，提高動(dòng)物的健康水平，達(dá)到防病治療的效果。