白金慧, 張 萌, 姚立萍, 王 琳, 申亞茹, 時雅倩, 花秀鳳, 陳清西, 文志豐

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 福建 福州 350018；3.福州市蔬菜科學(xué)研究所，福建 福州 350111)

草莓(FragariaananassaDuch.)為薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)多年生草本植物，是一種經(jīng)濟價值較高的小漿果，其栽培面積和產(chǎn)量始終居世界小漿果生產(chǎn)首位[1-2].在草莓的生產(chǎn)過程中，炭疽病是危害草莓生長的重要真菌病害，嚴重影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì).目前，草莓炭疽病防治以化學(xué)防治為主，但在實際應(yīng)用中存在盲目用藥和用藥品種單一等弊端，導(dǎo)致防治效果不理想，而且長期使用化學(xué)藥劑使炭疽菌的抗藥性日漸增強，引起病害蔓延，因此培育抗病品種是防治草莓炭疽病的最有效途徑[1-2].我國野生草莓資源豐富，其中，黃毛草莓(FragarianilgerrensisSchltdl. ex Gay.)是二倍體野生種，具有獨特的果香和果色，生長健壯，抽生能力強，具有抗旱、抗寒和抗病性等特點[4-5].研究人員對黃毛草莓進行了田間自然發(fā)病率調(diào)查，并結(jié)合人工接種試驗對黃毛草莓進行了炭疽病抗性評價，結(jié)果顯示，黃毛草莓對炭疽病有較強的抗性[6-8].利用黃毛草莓對炭疽病抗性較強的特點，從中挖掘抗病基因并研究其抗病機理，將傳統(tǒng)雜交育種與分子育種手段相結(jié)合，創(chuàng)新育種材料，是實現(xiàn)草莓抗性育種的有效途徑.

植物堿性螺旋—環(huán)—螺旋(basic helix-loop-helix， bHLH)轉(zhuǎn)錄因子是植物第二大類轉(zhuǎn)錄因子，不僅參與植物的生長發(fā)育和生理代謝發(fā)育，還廣泛參與調(diào)控免疫反應(yīng)、抗逆反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程[9].bHLH家族成員有兩個保守的結(jié)構(gòu)域：堿性區(qū)域和螺旋—環(huán)—螺旋(helix-loop-helix, HLH)區(qū)域[10].目前已在葡萄(VitisviniferaLinn.)[11]、杜梨(PyrusbetulaefoliaBge)[12]和草莓[13]等園藝作物中鑒定出bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因.Tai et al[14]研究了馬鈴薯(SolanumtuberosumLinn.)58個bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因在接種疥瘡鏈霉菌(Streptomycesscabies)后的表達模式，發(fā)現(xiàn)有3個bHLH基因參與了馬鈴薯對瘡痂病的防御反應(yīng)；Jung et al[15]通過對轉(zhuǎn)錄譜的分析，鑒定到一個番茄(LycopersiconesculentumMill)轉(zhuǎn)錄因子基因SlbHLH132在受到黃單孢菌(Xanthomonaseuvesicatoria)侵染后誘導(dǎo)表達，其轉(zhuǎn)錄激活受到黃單孢菌SUMO蛋白的調(diào)控；Yu et al[16]利用全基因組鑒定了本氏煙草(NicotianabenthamianaLinn.)NbbHLHs的基因家族，發(fā)現(xiàn)有28個候選NbbHLHs基因參與調(diào)控疫霉菌(Phytophthoranicotianae)的抗性；Cheng et al[17]研究表明，大豆[Glycinemax(Linn.) Merrill]bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmPIB1可增強對疫霉菌(Phytophthoranicotianae)的抗性；尹歡[18]從葡萄中鑒定出110個bHLH基因，其中，VvbHLH039基因參與葡萄抗逆脅迫過程；He et al[19]研究表明，陸地棉(GossypiumhirsutumLinn.)GhJAZ2可通過抑制GhbHLH171基因的轉(zhuǎn)錄活性來減弱棉花對大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)的抗性，GhbHLH171基因在棉花中的過表達可激活茉莉酸(JA)的合成和信號通路，提高了植株對大麗輪枝菌的抗性.目前，從草莓中已鑒定出113個bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員[20]，如FabHLH17、FabHLH3、FvbHLH78-like、FabHLH78基因等，研究主要集中在基因表達以及參與草莓果實花青素合成等方面[20-22].關(guān)于bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與草莓抗病的研究目前尚未見報道.

黃毛草莓對環(huán)境適應(yīng)性強，并且具有抗高溫、耐寒和抗葉部病害等特點[23].本課題組前期以黃毛草莓為材料，接種膠孢炭疽菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Sacc]后，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)從黃毛草莓中篩選到一個受膠孢炭疽菌誘導(dǎo)表達上調(diào)的bHLH基因，本研究克隆了該基因cDNA序列和啟動子序列，進行了生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建了FnbHLH68基因過表達載體和基因沉默載體.利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析了黃毛草莓葉片分別用膠孢炭疽菌和水楊酸處理后，F(xiàn)nbHLH68基因表達水平的變化.本研究為進一步探討黃毛草莓FnbHLH68轉(zhuǎn)錄因子基因參與抗膠孢炭疽菌的分子機理提供了參考.

1 材料與方法

1.1 材料

黃毛草莓取自福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院教學(xué)實踐基地.接種的膠孢炭疽菌菌株FZ-1由本實驗室保存[23].

PCR Master Mix購于天根公司；限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ、KpnⅠ、XbaⅠ)、DNA Marker購于TaKaRa公司；氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)等購于生工生物工程(上海)有限公司，其他常規(guī)試劑均為分析純.

RNAprep Pure Plant Kit多糖多酚RNA提取試劑盒、DNA Secure Plant Kit植物基因組DNA提取試劑盒、Universal DNA Purification Kit DNA純化回收試劑盒、TIANprep Mini Plasmid Kit質(zhì)粒小提試劑盒均購于天根公司；pMDTM20-T克隆載體購于TaKaRa公司；植物過表達載體pCAMBIA1300、0380:GUS和pTRV2載體均由本實驗室保存.

用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計引物，由尚亞生物技術(shù)(福州)有限公司合成，引物信息如表1所示.

表1 FnbHLH68基因的擴增及定量引物序列Table 1 Amplification and sequence of quantitative primer of FnbHLH68 gene

1.2 樣品處理

將黃毛草莓培養(yǎng)于植物培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度控制在23～25 ℃，濕度設(shè)為85%.

膠孢炭疽菌菌株FZ-1在培養(yǎng)基上活化后放置培養(yǎng)箱(25 ℃)中培養(yǎng)15 d，用液體PDA培養(yǎng)基進行搖菌，3～5 d后進行集菌，用蒸餾水制成濃度為1×106個·mL-1的孢子懸浮液.將孢子懸浮液均勻噴灑在黃毛草莓葉片上，對照組噴灑蒸餾水.發(fā)病培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃、濕度85%、光周期為12 h光照∶12 h黑暗、光照強度125 μmol·m-2·s-1.取接種后0、6 、12 、24 、48 和72 h等時間段植株從上往下數(shù)的第3～5位葉片，置于冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆?

將100 μmol·L-1水楊酸(Sigma公司的分析純)以噴霧的方式均勻噴施在草莓葉片上至有水滴滴下，對照組噴蒸餾水，取處理0、6、12 、24和48 h等時間段的葉片，置于冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆?

1.3 黃毛草莓FnbHLH68基因cDNA的克隆和生物信息學(xué)分析

分析膠孢炭疽菌侵染后的黃毛草莓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，篩選到一條在病原菌侵染后表達量顯著上調(diào)的Unigene序列，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計上游引物FnbHLH68-F(5′-ATGAATAGAGGTCATGTTTTACA-3′)和下游引物FnbHLH68-R(5′-TCACCTTGAAGGTAGGTTGGGCTG-3′).以膠孢炭疽菌侵染后不同時間段的黃毛草莓葉片cDNA混樣為模板，反應(yīng)體系25 μL，反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性90 s；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，將回收的目的片段純化后連接pMDTM20-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，菌液經(jīng)PCR擴增驗證后，挑選5個陽性克隆送至鉑尚生物技術(shù)(福州)有限公司進行測序分析.在NCBI上進行開放閱讀框分析和Blast同源比對；使用DNAMAN 7.0軟件進行不同物種間bHLH68基因編碼氨基酸序列的相似性比較及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建；使用ExPASy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)對FnbHLH68蛋白的理化性質(zhì)進行預(yù)測；使用SOPMA在線工具(https://npsa-prabi.bcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page-npsa sopma.html)對FnbHLH68蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測.

1.4 黃毛草莓FnbHLH68基因過表達載體和基因沉默載體的構(gòu)建

以含有FnbHLH68目的質(zhì)粒為模板，設(shè)計帶有BamHⅠ和XbaⅠ限制性酶切位點的上游引物FnbHLH68-OVER-F(5′-CGGGATCCCGATGAATAGAGGTCATGTTTTACA-3′)和下游引物FnbHLH68-OVER-R(5′-GCTCTAGAGCTCACCTTGAAGGTAGGTTGGGCTG-3′).PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收后進行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切，同時進行pCAMBIA1300-HA-35S目標載體BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切.回收兩者的酶切產(chǎn)物后用T4DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，菌液經(jīng)PCR擴增驗證后提取質(zhì)粒，利用BamHⅠ和XbaⅠ進行雙酶切驗證，挑取陽性克隆送至鉑尚生物技術(shù)(福州)有限公司進行測序分析.

根據(jù)FnbHLH68序列的基因沉默區(qū)設(shè)計帶有BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點的基因沉默載體引物，以含有FnbHLH68基因的目的質(zhì)粒為模板，PCR產(chǎn)物擴增回收后，利用BamHⅠ和XbaⅠ進行雙酶切，同時進行基因沉默載體BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切.回收純化兩者的目的條帶，采用T4DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，菌液經(jīng)PCR擴增驗證后提取質(zhì)粒，利用BamHⅠ和XbaⅠ進行雙酶切驗證，挑取陽性克隆送至鉑尚生物技術(shù)(福州)有限公司進行測序分析.

1.5 黃毛草莓FnbHLH68基因啟動子的克隆

以黃毛草莓基因組DNA為模板，利用森林草莓(FragariavescaLinn.)bHLH68的序列信息查找FnbHLH68啟動子的同源序列.采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計啟動子擴增的上游引物P-FnbHLH68-F(5′-GTGGCCATTTTATCAACATGTGAG-3′)和下游引物P-FnbHLH68-R(5′-GCCTTAGTCTCCTGAACTTGGCTT-3′)，進行PCR擴增，擴增程序為:94 ℃預(yù)變性90 s ；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，36個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)回收連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，進行菌液PCR鑒定，陽性克隆送至鉑尚生物技術(shù)(福州)有限公司進行測序分析.

1.6 黃毛草莓FnbHLH68基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測

采用RNA試劑盒分別提取黃毛草莓葉片在膠孢炭疽菌脅迫0、6、12、24、48和72 h后的總RNA，水楊酸處理0、6、12、24 和48 h后的總 RNA以及相應(yīng)對照組的總RNA，使用Prime Script?RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于實時熒光定量PCR檢測.反應(yīng)體系為：6.25 μL SYBR Premix ExTaqTM、上下游引物各0.5 μL、1 μL cDNA模板、4.25 μL無菌水.擴增程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火30 s；循環(huán)40次.以草莓Actin基因(GenBank登錄號：AB116565)為黃毛草莓內(nèi)參基因，每個樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù).用2-△△CT方法分析FnbHLH68基因的相對轉(zhuǎn)錄水平[24]，并用Excel 2010和SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析.

A：FnbHLH68基因PCR擴增(1：FnbHLH68基因目的條帶； M:DL5000 Marker)；B：菌液陽性克隆PCR擴增驗證(1～4：PCR擴增檢測菌液陽性克??；M:DL5000 Marker).圖1 黃毛草莓FnbHLH68基因克隆及檢測的電泳圖譜Fig.1 Cloning and electrophoretogram of FnbHLH68 gene in F.nilgerrensis

2 結(jié)果與分析

2.1 黃毛草莓FnbHLH68基因的克隆和生物信息學(xué)分析

以黃毛草莓葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴增到一條長度大于1 000 bp的特異條帶(圖1).測序后顯示該條帶長度為1 161 bp，序列比對分析發(fā)現(xiàn)，克隆的序列與森林草莓bHLH68高度同源，命名為FnbHLH68 (GenBank登陸號：MN879282)，其開放閱讀框長1 161 bp，編碼386個氨基酸(圖2)，在第243～287位氨基酸處有一個保守的HLH結(jié)構(gòu)域，表明FnbHLH68基因?qū)儆赽HLH基因家族成員.

使用ExPASy在線工具進行蛋白質(zhì)預(yù)測分析的結(jié)果顯示，該基因預(yù)測編碼的蛋白質(zhì)分子式為C1820H2836N532O577S18，分子質(zhì)量約為41.98 ku，理論等電點(pI)約為6.92，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為69.26%，親水系數(shù)為-0.589，因此預(yù)測該蛋白為不穩(wěn)定的疏水蛋白.使用SOPMA在線工具對FnbHLH68蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果(圖3)顯示，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所占比例最大，為66.58%，其次分別是α-螺旋(23.83%)、延伸鏈(7.51%)和β-轉(zhuǎn)角(2.07%).利用GenBank上公布的bHLH68基因編碼的氨基酸序列，使用DNAMAN 7.0軟件進行多物種間氨基酸序列的相似性比對.結(jié)果(圖4)顯示，F(xiàn)nbHLH68基因編碼的氨基酸序列與森林草莓、月季(RosachinensisLinn.)、白梨(PyrusbretschneideriRehd.)、梅(PrunusmumeSieb.)、核桃(JuglansregiaLinn.)、歐洲栓皮櫟(QuercussuberLinn.)、東京櫻花(PrunusyedoensisMatsum.)、巴西橡膠(HeveabrasiliensisMuell.)和海棠(MalusdomesticaSchneid.)的相似性分別為98.45%、93.30%、70.40%、69.87%、69.85%、69.77%、69.62%、69.33%和69.33%.利用DNAMAN 7.0軟件構(gòu)建黃毛草莓FnbHLH68蛋白與同源蛋白的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果(圖5)顯示，黃毛草莓FnbHLH68基因編碼的氨基酸與森林草莓、月季聚為一小類，親緣關(guān)系最近，這三者均屬于薔薇亞科.

方框中的序列表示起始密碼子和終止密碼子；下劃線部分表示HLH保守結(jié)構(gòu)域.圖2 黃毛草莓FnbHLH68核苷酸序列與推測的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of FnbHLH68 in F.nilgerrensis

A:二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;B:信號肽結(jié)構(gòu)預(yù)測.圖3 黃毛草莓FnbHLH68蛋白的二級結(jié)構(gòu) 預(yù)測和信號肽結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Predictions on secondary structure and peptide structure of FnbHLH68 protein in F.nilgerrensis

2.2 黃毛草莓FnbHLH68基因過表達載體和基因沉默載體的構(gòu)建

以克隆測序正確的含F(xiàn)nbHLH68質(zhì)粒為模板，設(shè)計帶有BamHⅠ和XbaⅠ的過表達載體和基因沉默載體引物，通過PCR擴增獲得1 161 bp的目的基因開放閱讀框區(qū)和472 bp的基因沉默區(qū)(圖6).回收后，分別與已用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切的pCAMBIA1300-HA-35S和p-TRV2載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中.菌液經(jīng)PCR擴增驗證后，提取陽性質(zhì)粒利用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切，送尚亞生物技術(shù)(福州)有限公司測序，成功構(gòu)建植物過表達載體pCAMBIA1300-HA-35S-FnbHLH68和基因沉默載體pTRV2-FnbHLH68(圖6).

2.3 黃毛草莓FnbHLH68基因啟動子的克隆

以黃毛草莓DNA為模板，使用P-FnbHLH68-F(5′-GTGGCCATTTTATCAACATGTGAG-3′)和P-FnbHLH68-R(5′-GCCTTAGTCTCCTGAACTTGGCTT-3′)引物PCR擴增FnbHLH68啟動子(命名為pFnbHLH68，GenBank登陸號：MW218450)，測序結(jié)果(圖7)顯示，擴增得到的啟動子長度為1 849 bp.使用PlantCare在線軟件對序列進行預(yù)測(附件圖Ⅰ，掃OSID碼可見)，發(fā)現(xiàn)啟動子序列上除含有啟動子的基本元件TATA-box和CAAT-box等以外，還存在著參與脫落酸響應(yīng)的順式作用元件ABRE、參與MeJA反應(yīng)的順式作用調(diào)節(jié)元件CGTCA-motif、參與愈傷調(diào)節(jié)元件WUN-motif以及參與光反應(yīng)的G-box、BOX 4、I-box、TCT-motif、chs-CMAla和AE-box等元件，這些元件的存在表明黃毛草莓FnbHLH68啟動子可能響應(yīng)多種生物和非生物脅迫(表2).

FnbHLH68:黃毛草莓(Fragaria nilgerrensis Schltdl. ex Gay.)MK685675;FvbHLH68:森林草莓(Fragaria vesca Linn.)XP_011464892.1; HbbHLH68:巴西橡膠(Hevea brasiliensis Muell.)XP_021675294.1;JrbHLH68:核桃(Juglans regia Linn.)XP_018815054.1. 下劃線部分表示HLH保守結(jié)構(gòu)域.圖4 黃毛草莓FnbHLH68基因編碼的氨基酸與其他物種氨基酸的序列比較Fig.4 Comparison of homology amino acid sequences encoded by FnbHLH68 gene from F.nilgerrensis and other species

圖5 黃毛草莓FnbHLH68蛋白與同源蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of FnbHLH68 protein in F.nilgerrensis and homologous protein

A:FnbHLH68過表達載體的構(gòu)建(1、2分別為BamHⅠ、XbaⅠ雙酶切重組質(zhì)粒;3、4分別為BamHⅠ、XbaⅠ酶切驗證 pCAMBIA1300-HA-35S-FnbHLH68；M:DL5000 Marker);B::FnbHLH68基因沉默載體的構(gòu)建(1、2分別為FnbHLH68 基因加入BamHⅠ、XbaⅠ酶切位點PCR擴增片段;3、4分別為BamHⅠ、XbaⅠ酶切重組質(zhì)粒;5、6分別為 BamHⅠ、XbaⅠ酶切驗證pTRV2-FnbHLH68-VIGS;M:DL5000 Marker).圖6 黃毛草莓FnbHLH68基因過表達載體構(gòu)建和基因沉默載體構(gòu)建的電泳圖譜Fig.6 Electrophoresis of the constructed overexpression vector and silencing vector for FnbHLH68 gene in F.nilgerrensis

1～2為FnbHLH68基因啟動子PCR擴增;3～4為FnbHLH68啟動 子菌液PCR陽性克隆驗證;M:DL5000 Marker.圖7 黃毛草莓FnbHLH68基因啟動子克隆的電泳圖譜Fig.7 Electrophoretogram of promoter of FnbHLH68 gene in F.nilgerrensis

2.4 不同處理下黃毛草莓FnbHLH68基因的相對表達量

黃毛草莓葉片接種膠孢炭疽菌后，采用實時熒光定量PCR檢測FnbHLH68基因相對表達量的變化.結(jié)果(圖8)顯示：FnbHLH68基因響應(yīng)膠孢炭疽菌的脅迫處理，在接種膠孢炭疽菌0～6 h后FnbHLH68基因的表達量逐漸升高，接種12 h后該基因的表達水平達到最高，為0 h的10.6倍，接種48 h后FnbHLH68基因的表達水平開始下降；接種12、24、48和72 h后的FnbHLH68基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于對照.表明黃毛草莓FnbHLH68基因的表達受膠孢炭疽菌誘導(dǎo)，可能參與黃毛草莓對炭疽病的防御反應(yīng).

用外源水楊酸處理黃毛草莓葉片后，分析水楊酸誘導(dǎo)后FnbHLH68基因的表達情況.結(jié)果(圖9)顯示：在水楊酸處理6、12、24和48 h后，F(xiàn)nbHLH68基因的表達量呈先上升后下降的趨勢；處理12 h后的FnbHLH68基因表達量達到最高值，為0 h的11.5倍.表明水楊酸誘導(dǎo)黃毛草莓FnbHLH68基因的表達.

表2 黃毛草莓FnbHLH68基因啟動子序列及順式作用元件預(yù)測Table 2 Sequence and cis-acting elements prediction of FnbHLH68 gene promoter from F.nilgerrensis

附不同字母者表示在0.05水平上差異顯著，附相同字母者表示在0.05水平上差異不顯著.圖8 黃毛草莓葉片接種草莓膠孢炭疽菌后FnbHLH68基因的相對表達量Fig.8 Relative expression of FnbHLH68 gene in leaves of F.nilgerrensis inoculated with C.gloeosporioides

附不同字母者表示在0.05水平上差異顯著，附相同字母者表示在0.05水平上差異不顯著.圖9 黃毛草莓葉片用外源水楊酸處理后FnbHLH68基因的相對表達量Fig.9 Relative expression of FnbHLH68 gene in leaves of F.nilgerrensis treated with exogenous salicylic acid

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子是一類位于細胞核內(nèi)，能夠通過特定的氨基酸殘基與靶基因啟動子區(qū)域上的順式反應(yīng)元件相互作用，進而調(diào)控相關(guān)基因表達的蛋白質(zhì)[25].大量研究表明，高等植物的轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育、抗逆反應(yīng)和次生代謝等方面都具有重要作用.bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子中很重要的一個家族，數(shù)量眾多，其超家族的成員具有兩個保守但功能不同的結(jié)構(gòu)域，分別是氨基末端的基本DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(E-box)及羧基末端的HLH結(jié)構(gòu)域，其中，HLH結(jié)構(gòu)域賦予異源或同源二聚化蛋白質(zhì)[26].本研究利用同源克隆技術(shù)，從野生黃毛草莓葉片中克隆到FnbHLH68基因cDNA序列，其編碼的氨基酸包含一個HLH保守結(jié)構(gòu)域.多物種間氨基酸序列相似性比對的結(jié)果顯示，F(xiàn)nbHLH68氨基酸序列與森林草莓、月季氨基酸序列的相似性較高，這三者均屬于薔薇亞科，推測其蛋白功能也可能相近.克隆了FnbHLH68基因上游的啟動子序列，進而分析發(fā)現(xiàn)啟動子序列含有激素響應(yīng)元件MeJA、愈傷調(diào)節(jié)元件WUN-motif以及參與光反應(yīng)的G-box等多種類型的順式作用元件，對研究啟動子轉(zhuǎn)錄活性有很大的幫助.

植物在應(yīng)答生物或非生物脅迫時，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生轉(zhuǎn)錄重排并誘導(dǎo)下游某些防御反應(yīng)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在植物受到逆境脅迫時起著重要的調(diào)控作用[18].本課題組前期研究表明，野生黃毛草莓接種膠孢炭疽菌6 h后，F(xiàn)nbHLH68轉(zhuǎn)錄因子基因表達上調(diào)，表明該基因可能參與對炭疽病抗性的調(diào)控；馬達[27]研究表明，擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因HFR1參與對丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringae)抗性的調(diào)控；Wang et al[28]研究表明，小麥bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因TabHLH060增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥對丁香假單胞桿菌的敏感性；Wang et al[29]研究表明，番茄SlbHLH131基因參與對黃葉卷曲病毒抗性的調(diào)控；Cheng et al[17]研究表明，大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmPIB1可增強大豆疫霉菌的抗性；薛寶平[30]研究表明，辣椒在接種青枯菌(Pseudomonassolanacearum)1 h后，CabHLH94基因轉(zhuǎn)錄表達開始顯著上調(diào)，6 h后達到最大值，此外還可被外源激素水楊酸、脫落酸、MeJA、乙烯和蕓苔素內(nèi)酯誘導(dǎo)上調(diào)，轉(zhuǎn)基因辣椒對青枯菌的侵染起到了抗病性作用；高敏[31]在葡萄上接種黑痘病病原菌(Sphacelomaampelinum)后，有7個VvbHLH基因在抗黑痘病毛葡萄‘商-24’和感黑痘病的‘紅地球’中表達上調(diào)，在接種白粉菌(Erysiphenecator)后，有13個VvbHLH基因在毛葡萄‘商-24’中表達上調(diào)；本研究在黃毛草莓上接種膠孢炭疽菌后，F(xiàn)nbHLH68基因的表達水平均顯著高于對照組，接種12 h后的表達水平最高，為對照組的10.6倍，接種24 h后的表達水平逐漸下降，推測該基因可能參與抗炭疽病反應(yīng).

水楊酸在植物防衛(wèi)信號傳導(dǎo)中起著重要作用，其介導(dǎo)的信號途徑與植物抗性密切相關(guān)，是激活植物超敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得抗性的內(nèi)源信號分子[32].楊金華[33]利用外源激素水楊酸處理‘富士’蘋果幼苗后，MdbHLH050基因表達下調(diào)，15個bHLH基因表達上調(diào)，推測這些bHLH基因受水楊酸信號調(diào)控；周宏駿等[34]研究表明，丹參幼苗用水楊酸處理后，SmbHLH93基因的表達開始受到了明顯的抑制，處理24 h后其表達量有所升高，但仍顯著低于對照；韓永濤等[35]采用水楊酸處理茶樹品種‘陜茶一號’后，CsbHLH2基因受水楊酸誘導(dǎo)表達，處理12 h后的表達量達到最高.上述研究結(jié)果表明，bHLH基因可以被水楊酸誘導(dǎo)表達.本研究用水楊酸處理黃毛草莓葉片后，F(xiàn)nbHLH68基因的表達水平整體上比無菌水處理的對照組高，處理12 h后的表達水平達到最高，是對照組的11.5倍.推測FnbHLH68基因可能通過水楊酸信號途徑參與對炭疽病抗性的調(diào)控.