沈 碩

(1.青海大學農(nóng)林科學院；2.青海省馬鈴薯育種重點實驗室；3.青藏高原生物技術(shù) 教育部重點實驗室，青海 西寧 810016)

鐮刀菌(Fusariumspp.)侵染馬鈴薯塊莖后會引起馬鈴薯干腐病的發(fā)生，馬鈴薯干腐病是一種窖藏病害，其不僅嚴重危害貯藏期馬鈴薯種薯質(zhì)量，還會影響下一年馬鈴薯出苗及隨后的生長發(fā)育，從而大大降低馬鈴薯產(chǎn)量和商品價值[1-2].對馬鈴薯干腐病的防治主要依靠化學藥劑，但化學防治存在環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、菌株抗藥等問題.我國于2016年提出“減化肥、減農(nóng)藥”的雙減目標，微生物及其次級代謝產(chǎn)物由于具有無毒、無污染、可持續(xù)、活性優(yōu)和可降解等顯著優(yōu)勢，而成為植物病害生物防治和實現(xiàn)雙減目標的重要選擇[3].

國內(nèi)外學者研究獲得的馬鈴薯干腐病生防菌株主要包括放線菌(Actinomycesspp.)[4-7]、芽孢桿菌(Bacillusspp.)[8]和木霉菌(Trichodermaspp.)[9].此外，有學者研究了馬鈴薯非親和菌株粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)菌絲細胞壁萃取物對馬鈴薯干腐病的拮抗作用[10].但有關(guān)嗜鹽菌對馬鈴薯干腐病的抑制作用尚未見報道.嗜鹽菌是一種極端環(huán)境微生物，有關(guān)來源于鹽湖的中度嗜鹽菌的研究主要包括新菌種的發(fā)現(xiàn)及鑒定、群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析、植物病害及改善大腸桿菌的耐鹽堿能力等[11-13].近年來，本研究小組從茶卡、察爾汗鹽湖等區(qū)域發(fā)現(xiàn)了包括菌株ST77在內(nèi)的大量具有農(nóng)用活性的菌株.本試驗對中度嗜鹽菌ST77及其萃取物抑制馬鈴薯干腐病病原真菌的活性及活體防效進行研究，以期為先導(dǎo)化合物的分離鑒定及微生物源新型抗菌劑的研發(fā)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：中度嗜鹽菌菌株ST77分離自青海察爾汗鹽湖湖泥樣本；馬鈴薯干腐病病原真菌青9A-4-13(F.acuminatum)和青9A-5-2(F.solani)分離自馬鈴薯青薯9號薯塊病樣，病原真菌65B-2-6(F.trinctum)分離自馬鈴薯下寨65薯塊病樣.上述菌株保存于青海省農(nóng)林科學院生物技術(shù)研究所，活化后備用.

供試培養(yǎng)基：ATCC213改良培養(yǎng)基[MgSO4·7H2O 10 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，KCl 5 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏10 g，NaCl 40 g，瓊脂粉12 g(液體培養(yǎng)基不加瓊脂粉)，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.2～7.4，在121 ℃下高壓濕熱滅菌25 min][11]；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基[14].

供試馬鈴薯品種：青薯2號，為一級原種，由青海省農(nóng)林科學院生物技術(shù)研究所提供.

1.2 方法

1.2.1 供試菌株的培養(yǎng)及ST77發(fā)酵液的制備 將菌株ST77劃線接種于ATCC213改良培養(yǎng)基平板上進行活化，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.活化后的ST77菌株接種于ATCC213改良液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃下200 r·min-1的搖瓶柜中培養(yǎng)5 d，收獲發(fā)酵液.

將病原真菌青9A-4-13、青9A-5-2和65B-2-6分別接種于PDA培養(yǎng)基平板上進行活化，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后備用.

1.2.2 菌株ST77萃取物及其溶液的制備 將菌株ST77的發(fā)酵液分別用等體積的乙酸乙酯、氯仿和正丁醇在分液漏斗中萃取3次，萃取后的有機相合并后經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取物，備用.

稱取適量的3種萃取物溶解于1 mL二甲基亞砜(DMSO)中，用無菌水分別將3種萃取物配成20 mg·mL-1的原液，在4 ℃下，經(jīng)2 000 r·min-1離心、0.22 μm微孔濾膜抽濾后，用無菌水稀釋為10、5和1 mg·mL-1的萃取物溶液，備用.

1.2.3 菌株ST77抑菌活性的測定 參照Sadfi et al[15]的方法，在直徑9 cm培養(yǎng)皿底部用“十字交叉法”劃線，并以交叉點為中心，中心點接種中度嗜鹽菌ST77，在距離中心點2.5 cm呈對稱分布的4個點接種直徑5 mm的同一種病原真菌菌餅.每個培養(yǎng)皿為1個處理，每個處理重復(fù)3次，以只接種病原真菌的培養(yǎng)皿作為對照.分別在培養(yǎng)3、7和14 d后計算抑制率(inhibition rate， IR). IR=(R1-R2)/R1×100%，R1代表對照中病原真菌的生長距離，R2代表各處理中病原真菌的生長距離.

1.2.4 菌株ST77萃取物抑菌活性的測定 將牛津杯置于PDA培養(yǎng)基平板中央，分別加入1、5、10和20 mg·mL-1的萃取物溶液200 μL，在距培養(yǎng)皿中心2.5 cm呈對稱分布的4個點接種待測的3種馬鈴薯干腐病病原真菌菌餅(6 mm).以只接種病原真菌菌餅的培養(yǎng)皿作為對照，每個處理重復(fù)3次，待對照平板長滿菌落時測量抑菌帶寬.抑菌率計算方法同1.2.3.

1.2.5 菌株ST77發(fā)酵液和萃取物對馬鈴薯活體防效的測定及其安全性評價 參照Sadfi et al[15]的方法，將活化好的供試馬鈴薯病原真菌接種至PDA液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃下180 r·min-1的搖瓶柜中培養(yǎng)2 d；將活化好的菌株ST77置于37 ℃下200 r·min-1的搖瓶柜中培養(yǎng)2 d，分別收獲發(fā)酵液.運用血球計數(shù)板測定病原真菌孢子數(shù)和菌株ST77細胞濃度，將病原真菌孢子濃度調(diào)整至1.0×107個·mL-1，將菌株ST77細胞濃度調(diào)整到1.0×108cfu·mL-1，備用.

選擇貯藏于5～8 ℃下外觀整齊、無病蟲害的馬鈴薯青薯2號塊莖，經(jīng)自來水清洗，用2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min后立即用無菌水沖洗，自然晾干，用75%酒精進行表面消毒.在已消毒的馬鈴薯塊莖上用直徑為5 mm的打孔器均勻打2個深3 mm的孔.每個孔先接種40 μL病原真菌發(fā)酵液，再接入40 μL菌株ST77發(fā)酵液.以接種40 μL病原真菌發(fā)酵液和40 μL無菌水的處理為陽性對照，以接種40 μL菌株ST77發(fā)酵液和40 μL無菌水的處理為陰性對照.每個處理3個塊莖，重復(fù)3次.用PE保鮮袋(30 cm×40 cm)包裝接種完成的馬鈴薯塊莖，放入溫度28 ℃、相對濕度75%左右的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

14 d后測定馬鈴薯塊莖的壞果率、病斑深度以及菌株ST77發(fā)酵液的抑制率.

抑制率/%=(LP-LA)/LP×100

LP=未經(jīng)中度嗜鹽菌處理的馬鈴薯塊莖原質(zhì)量-鐮刀菌侵染后的質(zhì)量，LA=中度嗜鹽菌處理后的馬鈴薯塊莖原質(zhì)量-鐮刀菌侵染后的質(zhì)量.

菌株ST77萃取物對馬鈴薯活體防效的測定方法同上.

中度嗜鹽菌對馬鈴薯貯藏安全性的評價方法參照文獻[16-18].

1.2.6 菌株ST77的形態(tài)學鑒定 從培養(yǎng)基平板上刮取經(jīng)活化的菌株ST77，用1%葡萄糖溶液制成菌懸液，制片，光學顯微鏡(ZEISS 810-10022X)下觀察其形狀、大小、鞭毛和莢膜等形態(tài)特征，參照文獻[19-20]對菌株進行形態(tài)學鑒定.

1.2.7 菌株ST77的生理生化特征測定 參照文獻[19-20]測定菌株ST77的過氧化氫酶、氧化酶、β-半乳糖苷酶、硝酸鹽還原、明膠液化、淀粉水解、酪蛋白、精氨酸雙水解酶、精氨酸脫羧酶、H2S產(chǎn)生、水楊素、吲哚、溶血和脲酶等生理生化指標.

1.2.8 菌株ST77的分子生物學鑒定 按照上海生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式細菌DNA 提取試劑盒的操作程序提取菌株ST77的16S rDNA.選取細菌16S rDNA通用引物F27 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3′)和P1541(5′-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCGCA-3′)[11]進行擴增.PCR擴增體系：10×Buffer 2.5 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，dNTPs(2.5 mmol·μL-1)2 μL，上、下游引物(10 pmol·μL-1)各1 μL，補水至25 μL.反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收產(chǎn)物送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司測序.

1.2.9 統(tǒng)計與分析 運用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法分析各處理間的差異顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ST77對馬鈴薯干腐病病原真菌的抑制作用

由表1可知，對峙培養(yǎng)3 d后，中度嗜鹽菌ST77對病原真菌青9A-4-13、青9A-5-2和65B-2-6的抑制率分別為27.67%、25.33%和23.67%；對峙培養(yǎng)7 d后，ST77對青9A-4-13的抑制率有所下降，對青9A-5-2的抑制率略有上升，對65B-2-6的抑制率上升最明顯，為52.67%；對峙培養(yǎng)14 d后，ST77對3種病原真菌的抑制率均有所上升.由此可見，中度嗜鹽菌ST77對病原真菌65B-2-6的抑制活性最高且活性穩(wěn)定.

表1 中度嗜鹽菌ST77對馬鈴薯干腐病病原真菌的抑制率1)Table 1 The inhibitory rates of moderate halophilic strains ST77 against potato dry rot pathogen

2.2 菌株ST77有機溶劑萃取物對馬鈴薯干腐病病原真菌的抑制作用

由表2可知，菌株ST77的正丁醇萃取物對3種馬鈴薯干腐病病原真菌的抑制活性最高，氯仿萃取物的抑菌活性次之，乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最低；3種萃取物對病原真菌的抑制活性基本隨著萃取物濃度的升高而增強.其中，正丁醇萃取物對青9A-4-13、青9A-5-2和65B-2-6的最大抑制率分別達58.50%、56.50%和64.50%；氯仿萃取物濃度為20 mg·mL-1時對3種馬鈴薯干腐病病原真菌的抑制活性最高，抑制率分別達58.00%、40.00%和56.00%；乙酸乙酯萃取物濃度為10和20 mg·mL-1時，對65B-2-6的抑制活性較高，抑制率分別為50.00%和56.00%.由此可見，ST77正丁醇萃取物的抑菌活性最高，且對65B-2-6的抑制活性最高.

表2 中度嗜鹽菌ST77萃取物對馬鈴薯干腐病病原真菌的抑制率1)Table 2 The inhibitory rates of extracts from moderate halophilic strain ST77 against potato dry rot pathogen

表3 中度嗜鹽菌ST77對活體馬鈴薯干腐病 病原真菌的抑制作用1)Table 3 The inhibitory effect of moderate halophilic strain ST77 on potato dry rot pathogen in vivo

2.3 菌株ST77對活體馬鈴薯干腐病病原真菌的抑制作用

中度嗜鹽菌ST77發(fā)酵液對65B-2-6的抑制活性最高，抑制率達81.03%；對青9A-5-2的抑制活性次之，抑制率為67.71%；對青9A-4-13的抑制活性最低，壞果率為100.00%，病斑深度達2.11 cm，抑制率為46.53%(表3).

2.4 菌株ST77有機溶劑萃取物對活體馬鈴薯干腐病病原真菌的抑制作用

由表4和圖1可見，接種14 d后，3種有機溶劑萃取物對3種馬鈴薯干腐病病原真菌具有不同程度的抑制活性.氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物對病原真菌青9A-4-13和65B-2-6具有較高的抑制活性，且抑制率均隨著萃取物濃度的升高而增大；而正丁醇萃取物對病原真菌青9A-5-2和65B-2-6具有較高的抑制活性，且抑制率隨著萃取物濃度的升高而增大.

2.5 菌株ST77發(fā)酵液及其有機溶劑萃取物對馬鈴薯儲藏的安全性

ST77發(fā)酵液及其正丁醇萃取物對病原真菌65B-2-6的抑制活性均較高，因此，將馬鈴薯接種病原真菌65B-2-6后，分別經(jīng)ST77發(fā)酵液及其正丁醇萃取物處理，以進行安全性評價.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯表現(xiàn)出一定程度的失重，但創(chuàng)傷處無任何病害癥狀，病斑深度、病斑寬度及壞果率均為零.這說明中度嗜鹽菌ST77發(fā)酵液及其正丁醇萃取物對馬鈴薯儲藏安全.

表4 中度嗜鹽菌ST77萃取物對活體馬鈴薯干腐病病原真菌的抑制作用1)Table 4 The inhibitory effect of extracts from moderate halophilic strain ST77 against potato dry rot pathogen in vivo

圖1 中度嗜鹽菌ST77萃取物對活體馬鈴薯干腐病的防效Fig.1 The control effect of extracts from moderate halophilic strain ST77 on potato dry rot in vivo

2.6 菌株ST77的鑒定

2.6.1 形態(tài)特征 中度嗜鹽菌ST77為革蘭氏陽性菌，有莢膜，周生鞭毛，細胞形狀為細桿狀，大小為(0.6～0.8) μm×(0.5～0.6) μm.

2.6.2 生理生化特征 菌株ST77過氧化氫酶、氧化酶、β-半乳糖苷酶、硝酸鹽還原、明膠液化、淀粉水解、酪蛋白反應(yīng)呈陽性，精氨酸雙水解酶、精氨酸脫羧酶、H2S產(chǎn)生、水楊素、吲哚、溶血、厭氧和脲酶反應(yīng)呈陰性，符合芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)菌株的生理生化特征.

2.6.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 將擴增所得的ST77的16S rDNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列比對，并獲取登錄號MW012735.通過Mega 7.0軟件包，采用鄰接法，構(gòu)建菌株ST77及與其同源關(guān)系較近的其他菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2).由圖2可知，菌株ST77與已知菌株Bacilluspumilus(MN238693)聚于同一分支，親緣關(guān)系最近，同源性高達100%.

綜合形態(tài)特征、生理生化特征及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株ST77鑒定為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus).

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株ST77及其親緣關(guān)系相近菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenic tree of strain ST77 and its closely related strains based on sequences of 16S rDNA

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，平皿對峙試驗中，中度嗜鹽菌ST77發(fā)酵液及其萃取物對病原真菌具有不同程度的抑制活性.其中，正丁醇萃取物對病原真菌65B-2-6的抑制活性較高，培養(yǎng)14 d后可形成透明的抑菌圈，這說明芽孢桿菌能夠通過代謝途徑產(chǎn)生抗菌物質(zhì).活體試驗結(jié)果與平皿對峙試驗的結(jié)果一致，即ST77正丁醇萃取物對病原真菌65B-2-6的抑制活性最高.此外，中度嗜鹽菌ST77發(fā)酵液及其正丁醇萃取物對馬鈴薯儲藏安全.經(jīng)鑒定，中度嗜鹽菌ST77為短小芽孢桿菌.有研究顯示，短小芽孢桿菌部分種對馬鈴薯干腐病病原真菌F.culmorum、F.oxysporum和F.sambucinum無明顯的抑制活性[21]，與本試驗對馬鈴薯干腐病病原真菌F.acuminatum、F.solani和F.tricinctum的研究結(jié)果不同.這可能是由于不同馬鈴薯干腐病病原真菌存在特異性.今后可以通過正交試驗設(shè)計對ST77發(fā)酵配方及條件進行進一步的優(yōu)化，使發(fā)酵液及其萃取物的活性達到最高；進一步分離及純化ST77活性次級代謝產(chǎn)物，探明抑制馬鈴薯干腐病病原真菌的活性組分，進而為其作用機制的研究奠定基礎(chǔ).