黃小芳, 畢楚韻, 王和壽, 陳其俊, 胡韻卓, 黃碧芳, 許 明, 楊志堅, 陳選陽,5, 林世強,5

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)作物生物技術(shù)福建省高校重點實驗室, 福建 福州 350002;3.寧德市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,福建 寧德 352100;4.福建省種子總站 福建 福州 350003; 5.福建農(nóng)林大學(xué)教育部作物遺傳育種與綜合利用重點實驗室,福建 福州 350002)

轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中重要的一類調(diào)節(jié)因子，通過與順式元件相互作用來調(diào)節(jié)特定基因的表達以適應(yīng)環(huán)境的脅迫[1].bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，因其結(jié)構(gòu)域由Basic-Helix-Loop-Helix組成而得名.bHLH結(jié)構(gòu)域通常約由60個氨基酸組成，分為堿性氨基酸區(qū)和α螺旋-環(huán)-α螺旋區(qū)，堿性氨基酸區(qū)位于結(jié)構(gòu)域N端，主要負(fù)責(zé)識別和結(jié)合特定DNA，根據(jù)其中所含的堿性氨基酸數(shù)目和特異位點氨基酸的類型，可分為E盒結(jié)合(5′-CANNTG-3′)和G盒結(jié)合(5′-CACGTG-3′)；HLH區(qū)通過疏水性氨基酸的互作，促進蛋白形成同源/異源二聚體，從而使bHLH蛋白可以發(fā)揮功能作用[2].近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育、生物合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物與非生物脅迫以及一些次生代謝物的合成等方面均有參與.例如bHLH轉(zhuǎn)錄因子MYC2可通過整合各種決定植物生長發(fā)育的內(nèi)源性和外源性信號，在多個信號傳導(dǎo)途徑中充當(dāng)調(diào)節(jié)中心，而且還可以通過調(diào)節(jié)擬南芥中脯氨酸的生物合成來調(diào)節(jié)鹽脅迫下的耐受性[3]；研究表明[4]，擬南芥中bHLH121的功能缺失突變會引起嚴(yán)重的鐵缺乏癥狀，減少鐵的積累，并破壞與鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的表達，bHLH121可與bHLH IVc共同正向調(diào)節(jié)FIT(鐵缺乏癥的轉(zhuǎn)錄因子)的表達以維持?jǐn)M南芥中的鐵穩(wěn)態(tài).bHLH轉(zhuǎn)錄因子還參與調(diào)節(jié)植物的免疫反應(yīng)，在稻瘟病菌感染期間，水稻OsbHLH6基因表達上調(diào)，OsbHLH6通過動態(tài)調(diào)節(jié)水楊酸和茉莉酸的信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)水稻在稻瘟病菌脅迫下的防御機制[5].目前對甘薯中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能研究還未見報道.

本研究以甘薯泰中6號基因組測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)[6]，利用生物信息學(xué)方法對甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子進行檢索和鑒定，對其基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域保守性、基因在染色體的位置分布、系統(tǒng)進化樹以及真菌病害脅迫下和低溫脅迫下的基因差異表達進行分析，為甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子在抗性育種方面的應(yīng)用提供參考，同時豐富bHLH轉(zhuǎn)錄因子在不同物種中的研究.

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫下載甘薯全基因組序列，利用snap程序中附帶的HMM模型(At.hmm, Ce.hmm, Os.hmm)檢索甘薯15條染色體序列，得到178 458個CDS序列[7].

1.2 甘薯bHLH基因家族鑒定

從擬南芥數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站https://www.arabidopsis.org/index.jsp下載擬南芥bHLH序列，以此為基礎(chǔ)建立bHLH轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫.利用blastp將甘薯全基因組蛋白序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對(閾值設(shè)置為默認(rèn)值)，比對的輸出文件中比對成功的甘薯蛋白序列，統(tǒng)計每一條序列比對上的擬南芥bHLH序列數(shù)，選取其中與一半以上的擬南芥bHLH序列比對成功的甘薯蛋白序列為基礎(chǔ)，利用hmmbuild程序構(gòu)建甘薯特異的bHLH HMM模型.構(gòu)建好的HMM模型重新搜索甘薯所有的蛋白序列獲得含有bHLH結(jié)構(gòu)域的甘薯蛋白序列.利用CDD、Interproscan和Clustal Omega對獲得的序列進行驗證分析，去除不含bHLH結(jié)構(gòu)域的序列；利用augustus程序[8]對結(jié)構(gòu)域不完整的序列進行二次CDS區(qū)檢索以修補序列，并結(jié)合IGV軟件比較查看轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[9]的reads對應(yīng)bHLH序列在基因組區(qū)間的比對情況，最終得到甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因家族序列.

1.3 bHLH結(jié)構(gòu)域保守性分析

利用Clustal Omega[10]對甘薯bHLH序列進行多重比對.將比對后的甘薯bHLH結(jié)構(gòu)域與水稻bHLH結(jié)構(gòu)域的19個保守位點相比較，根據(jù)各個位點氨基酸的類型、數(shù)目、位置等信息確定甘薯bHLH結(jié)構(gòu)域的19個保守位點，并統(tǒng)計各個位點的氨基酸組成特征.

1.4 甘薯bHLH基因染色體定位

統(tǒng)計甘薯15條染色體的序列長度，根據(jù)snap程序獲得到ZFF文件中甘薯所有CDS序列的基因位置信息，對每個bHLH序列的位置信息進行查找并統(tǒng)計，利用circos程序[11]繪制圈圖，標(biāo)出bHLH基因在甘薯各染色體上的位置.為了尋找具有潛在復(fù)制關(guān)系的bHLH基因?qū)?，利用blastn程序兩兩比對甘薯bHLH基因序列，具有潛在復(fù)制關(guān)系的基因?qū)υ谌D中用線條進行連接.其中，含有潛在復(fù)制關(guān)系的基因需滿足以下兩個條件[12]：兩條序列比對后其覆蓋度超過較長序列的75%；序列比對后的相似度不小于75%.

1.5 甘薯bHLH motif分析

利用MEME程序[13]預(yù)測甘薯bHLH蛋白序列的保守基序，查找的保守基序最大數(shù)目為5，其它參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值.

1.6 甘薯bHLH系統(tǒng)進化樹分析

以多重比對后的bHLH蛋白序列為基礎(chǔ)，利用MEGA X[14]生成甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進化樹.采用鄰接法(N-J method)P-distance模型，空位選項為pairwise deletion，檢驗參數(shù)Bootstrap method值取1 000.

1.7 甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因表達分析

從EBI(https://www.ebi.ac.uk/)數(shù)據(jù)庫下載甘薯新種花(高感)和金山57(高抗)在尖孢鐮刀菌F04、F07脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[9]以及徐薯15-1和徐薯15-4低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[15]，其中，尖孢鐮刀菌脅迫下的甘薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，試驗組用F07/F04接種甘薯幼苗，分別為JS57_F07、JS57_F04和XZH_F07；對照組用水接種甘薯幼苗，分別為JS57_CK和ZXH_CK，共5個處理，每個處理3個重復(fù).Ji et al[15]將徐薯15-1和徐薯15-4的薯塊在4 ℃條件下儲存0周、2周、6周后進行測序，獲得甘薯在低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，6個處理組分別為Xushu15_1_Cold_0w、Xushu15_1_Cold_2w、Xushu15_1_Cold_6w、Xushu15_4_Cold_0w、Xushu15_4_Cold_2w和Xushu15_4_Cold_6w，每個處理重復(fù)3次.以143個甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列為基礎(chǔ)，通過Hisat2[16]建立bHLH索引文件，與下載的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)比對后，得到包含每個read與甘薯bHLH家族成員比對信息的sam文件.手動統(tǒng)計每個bHLH轉(zhuǎn)錄因子的read數(shù)，DESeq2標(biāo)準(zhǔn)化read數(shù).比較試驗組與對照組的標(biāo)準(zhǔn)化read數(shù)獲得log2FoldChange值(padj<0.05)利用pheatmap(https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html)繪制甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子的差異表達聚類圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯基因組中bHLH轉(zhuǎn)錄因子鑒定和分類

以144條擬南芥bHLH蛋白序列為基礎(chǔ)建立bHLH轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫，用于檢索甘薯全基因組蛋白質(zhì)序列，得到276條候選蛋白.選取其中特異性較高的bHLH序列建立甘薯特異的HMM模型，hmmsearch程序檢索得到191條bHLH候選蛋白.將blastp程序檢索得到的276條甘薯bHLH候選蛋白和hmmsearch程序檢索得到的191條bHLH候選蛋白合并、去除重復(fù)，共得到285條甘薯bHLH候選蛋白序列.經(jīng)過比對篩選，去除不含有bHLH結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域缺失嚴(yán)重的序列，最終得到143個甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子.研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域中含有19個保守位點[17](堿性氨基酸區(qū)5個，第一螺旋區(qū)5個，環(huán)區(qū)1個，第二螺旋區(qū)8個)，參考擬南芥bHLH結(jié)構(gòu)域的19個保守位點[18]，對經(jīng)序列比對后的甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域保守位點進行定位，統(tǒng)計獲得各個位點氨基酸的組成及其出現(xiàn)的頻率(表1).

bHLH結(jié)構(gòu)域的堿性氨基酸區(qū)是特定DNA的結(jié)合位點，與bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能相關(guān).參考水稻和擬南芥的分類結(jié)果[19]，根據(jù)bHLH蛋白DNA結(jié)合能力的不同對甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子進行分類(表2).以Toledo-Ortiz et al[18]的分類為參考：若bHLH轉(zhuǎn)錄因子中bHLH結(jié)構(gòu)域N端17個氨基酸中堿性氨基酸(Lys、Arg、His)數(shù)不少于5個，則認(rèn)為該蛋白具有DNA結(jié)合活性，少于5個的蛋白(HLH蛋白)不具有DNA結(jié)合活性，缺失堿性區(qū)的HLH蛋白雖然沒有DNA結(jié)合能力，但是可以與bHLH蛋白形成二聚體，bHLH轉(zhuǎn)錄因子通常以二聚體形式發(fā)揮作用.具有DNA結(jié)合活性的蛋白可分為E-盒結(jié)合和非E-盒結(jié)合，具有E-盒結(jié)合活性的蛋白第13位和16位氨基酸分別為谷氨酸(Glu)和精氨酸(Arg).另外，一些E-盒結(jié)合活性的蛋白具有與G-盒結(jié)合的能力，根據(jù)bHLH蛋白第9位和17位是否為賴氨酸/組氨酸(Lys/His)和精氨酸(Arg)進一步將E-盒結(jié)合分為G-盒結(jié)合和非G-盒結(jié)合.

表1 bHLH結(jié)構(gòu)域保守位點1)Table 1 Conservative sites of the bHLH transcription factors domains

表2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合活性Table 2 DNA binding activity of the bHLH transcription factors

2.2 甘薯bHLH家族成員在染色體上的分布

利用circos程序?qū)⒏适?43條bHLH蛋白序列對應(yīng)的基因定位到15條染色體上(圖1).從圖中可以看出，甘薯bHLH家族成員在15條染色體上分布并不均勻，在某些染色體上分布數(shù)量較多，如1號(15個)、2號(18個)、5號(15個)、6號(12個)以及14號(13個)染色體；而在其它染色體上分布的bHLH家族成員則較少，如第9和12號染色體，均只有4個bHLH轉(zhuǎn)錄因子.

為了判斷甘薯bHLH各家族成員之間的潛在復(fù)制關(guān)系，本研究利用blastn計算得到39個含有復(fù)制關(guān)系的基因?qū)?，用連線對其進行連接，其中存在于染色體內(nèi)的具復(fù)制關(guān)系基因?qū)τ?1對(藍(lán)色)，根據(jù)基因在染色體上的位置和序列之間的相似性可判斷基因簇，而具有潛在復(fù)制關(guān)系的基因?qū)χg的序列相似性均大于75%，因此，存在于染色體內(nèi)的緊密排列的具有重復(fù)關(guān)系的基因可認(rèn)為是基因簇，例如CM008331.1-snap.11624和CM008331.1-snap.11743在1號染色體上成簇狀分布，且兩序列之間的相似度為98%.從圖中可以發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)染色體內(nèi)成簇狀分布的基因均存在潛在的復(fù)制關(guān)系(圖1).另外，染色體間的具有潛在復(fù)制關(guān)系的基因有8對(橙色)，如2號染色體上CM008332.1-snap.11316及CM008332.1-snap.11318分別與11號染色體上的CM008341.1-snap.4864和CM008341.1-snap.1582、CM008341.1-snap.4863和CM008341.1-snap.1581成潛在復(fù)制關(guān)系.

圖中圓的不同顏色部分表示不同的染色體；藍(lán)色連接線條表示染色體內(nèi)重復(fù)基因?qū)?，橙色連接線條表示染色體間重復(fù)基因?qū)?圖1 甘薯bHLH基因的染色體定位和潛在復(fù)制關(guān)系Fig.1 Chromosomal localization and potential duplication relationship of I.batatas bHLH genes

2.3 bHLH結(jié)構(gòu)域保守性分析及MEME分析

為了研究甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域保守性，對得到的143條bHLH蛋白序列進行多重比對(圖2).從比對結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，甘薯bHLH結(jié)構(gòu)域大約由54個氨基酸組成，其中有21個保守性大于50%的位點(圖中陰影部分)，這些保守位點有6個位于堿性氨基酸區(qū)(Basic)(1-17)，5個位于第一螺旋區(qū)(Helix 1)(18-32)，2個位于環(huán)區(qū)(Loop)(33-39)，8個位于第二螺旋區(qū)(Helix 2)(40-54).21個保守位點中有10個位點的氨基酸保守性在70%以上，分別為13-E(76.9%)、14-R(78.3%)、16-R(97.9%)、17-R(90.9%)、27-L(99.3%)、32-P(86.0%)、36-K(74.8%)、44-L(77.6%)、50-Y(75.5%)和54-L(87.4%).堿性氨基酸區(qū)含有3個高度保守的精氨酸(Arg)殘基位點，作為堿性氨基酸在長期進化中在該區(qū)域保持著高度的保守性，說明這3個保守位點在堿性氨基酸區(qū)與特定DNA結(jié)合時有著重要的作用.兩個螺旋區(qū)均有高度保守的亮氨酸(Leu)殘基，其中第一螺旋區(qū)的27-Leu的保守性高達99.3%，已知動物中的Max蛋白bHLH結(jié)構(gòu)域27-Leu在形成二聚體時發(fā)揮重要作用，推測植物中該位點的Leu也具有重要功能[20].

利用MEME分析甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子，得到5個保守基序(圖3)，分別為motif 1(HSLAERRRREKINERLKALQSLVPGGSKM)、motif 2(DKASMLDEAIKYIKELQEQVE)、motif 3(EAPVPPEYVHVRARRGQATDS)、motif 4(LPEIEVRISGDDVLIRIHCSK)和motif 5(GLLLKIFSELEELGLEVVSASVSTFGDLA)，括號內(nèi)劃橫線部分表示該位點氨基酸高度保守.motif 1和motif 2共同組成甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子的bHLH結(jié)構(gòu)域，且這兩個基序在所有143條甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子中出現(xiàn)的頻率均在90%以上，其中142個甘薯bHLH家族成員中均含有motif 1，134個成員中均含有motif 2，表明甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子擁有較保守的bHLH結(jié)構(gòu)域.另外，有50個家族成員含有motif 5，而motif 3和motif 4則分別僅存在于23和34個家族成員中.

圖2 甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子保守性分析Fig.2 Conservation analysis of I.batatas bHLH transcription factors

2.4 甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進化樹分析

利用N-J法生成甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進化樹(圖4)，樹狀圖分枝上的Bootstrap值僅顯示大于50%，并以此作為甘薯bHLH亞家族的劃分標(biāo)準(zhǔn)[19]，將甘薯143個bHLH家族成員劃分為22個亞組，命名為S1～S22，各亞家族之間用不同顏色加以區(qū)分.分支上顯示的Bootstrap值大多在90%以上，說明構(gòu)建的進化樹可靠性較高[14,21].另外，圖中22個亞組所包含的bHLH轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目并不相同，囊括家族成員最多的是S12亞組(20個)；S5亞組次之(15個)；S4、S6、S13、S15以及S21均僅有2個成員.

圖3 甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子的基序分布Fig.3 Motif distribution of I.batatas bHLH transcription factors

圖中各亞家族之間用不同的顏色加以區(qū)分，即顏色相同的成員為同一亞家族.圖4 甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of I.batatas bHLH transcription factors

2.5 甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子在生物脅迫和非生物脅迫下的差異表達分析

Lin et al[9]將分離得到的甘薯尖孢鐮刀菌菌株F04和F07作為致病菌分別侵染甘薯高抗品種金山57(JS57)和高感品種新種花(XZH)，24 h后取其幼苗莖段進行轉(zhuǎn)錄組測序，我們利用以上轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)計算和繪制了甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)尖孢鐮刀菌脅迫時的基因表達變化圖(圖5).篩選得到6個bHLH轉(zhuǎn)錄因子在受到尖孢鐮刀菌脅迫時表達量發(fā)生顯著變化，分別為CM008332.1-snap.4569、CM008332.1-snap.13709、CM008333.1-snap.2180、CM008335.1-snap.7221、CM008340.1-snap.755和CM008340.1-snap.6800，篩選標(biāo)準(zhǔn)遵循log2FoldChange的絕對值≥1且padj<0.05.

圖5 甘薯bHLH基因在尖孢鐮刀菌Fob脅迫下的差異表達Fig.5 Differential expression of I.batatas bHLH genes under Fusarium oxysporum stress

從圖5中可以看出，6個響應(yīng)尖孢鐮刀菌脅迫的基因中，4個表達下調(diào)，2個表達上調(diào).用不同強度的致病菌F04和F07侵染同一甘薯品種金山57時，同一基因的表達量變化并不完全一致，如CM008332.1-snap.4569在F04侵染時，表達量下調(diào)，在F07侵染時，無明顯變化；CM008333.1-snap.2180、CM008335.1-snap.7221以及CM008340.1-snap.6800則僅在F07侵染時，表達量有所變化.其中，不同于CM008333.1-snap.2180和CM008335.1-snap.7221表達量呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢，CM008340.1-snap.6800在金山57響應(yīng)F07脅迫時，表達量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，且在感病品種新種花中，在同樣受到F07致病菌的脅迫時，CM008340.1-snap.6800表達量的上調(diào)幅度更大，log2FoldChange值高達4.23.

Ji et al[15]將甘薯品系Xushu15-1和Xushu15-4的塊根在4 ℃下冷藏0、2和6周后，對其進行了轉(zhuǎn)錄組分析.本研究利用該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析bHLH基因的差異表達(圖6)，結(jié)果表明，甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子中有44個基因在低溫脅迫下表達量發(fā)生變化，且大部分甘薯bHLH基因在低溫脅迫下表達量呈現(xiàn)下降的趨勢，有13個基因在4個處理組中的表達量均有變化，在4個處理組中均下調(diào)的基因為CM008332.1-snap.4569、CM008336.1-snap.7409、CM008339.1-snap.11735、CM008340.1-snap.2852、CM008341.1-snap.703、CM008341.1-snap.1579、CM008342.1-snap.9806和CM008344.1-snap.175；均上調(diào)的基因為CM008336.1-snap.12068、CM008336.1-snap.12070、CM008338.1-snap.11546、CM008338.1-snap.11553和CM008342.1-snap.9786，且CM008336.1-snap.12068和CM008336.1-snap.12070表達量上調(diào)幅度變化較大(log2FoldChange值>7.0).

圖6 甘薯bHLH基因低溫脅迫下的差異表達Fig.6 Differential expression of I.batatas bHLH genes under low temperature stress

2.6 甘薯部分bHLH基因序列位置信息

為了更直觀的表示甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子的序列信息，根據(jù)差異表達的分析結(jié)果，分別篩選出尖孢鐮刀菌脅迫下表達量變化最大的2個基因和冷脅迫下表達量變化最大的8個基因，其基因的序列位置信息如表3中所示.表中的基因名稱由染色體序列文件名和基因編號兩部分組成，用“-”符號分隔開，例如CM008332.1-snap.13709表示NCBI數(shù)據(jù)庫“泰中6號”基因組的染色體序列文件CM008332.1.fasta(第2號染色體)上根據(jù)snap預(yù)測的編號為snap.13709的基因.基因由1個或多個外顯子組成，表中外顯子的位置區(qū)間均以正義鏈坐標(biāo)為準(zhǔn)，鏈為“+”的基因取正義鏈的序列，鏈為“-”的基因取正義鏈反向互補的序列；外顯子排列順序按照其在基因中出現(xiàn)的順序，拼接外顯子即基因全長序列.

表3 甘薯部分bHLH基因序列信息Table 3 Sequence information of several bHLH genes of I.batatas

3 討論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物生長發(fā)育、生物合成及抗逆性等方面發(fā)揮重要作用.本研究基于生物信息學(xué)分析方法，從甘薯全基因組CDS序列中鑒定得到143個bHLH轉(zhuǎn)錄因子，與水稻(至少165個)，擬南芥(162個)及煙草(190個)相比數(shù)目略少[2].143個甘薯bHLH蛋白中的107(74.8%)個具有E-盒結(jié)合活性，其中81個(56.6%)具G-盒結(jié)合活性；水稻bHLH轉(zhuǎn)錄因子中具E-盒結(jié)合活性的蛋白占68.5%，具G-盒結(jié)合活性的占57.0%；擬南芥中為74.1%(E-盒結(jié)合)，60.5%(G-盒結(jié)合).從bHLH轉(zhuǎn)錄因子中具有E-盒/G-盒結(jié)合活性的蛋白所占的比例來看，甘薯與擬南芥和水稻的結(jié)果相似.

Atchley et al[22]運用統(tǒng)計學(xué)的方法，分析了242個生物中的bHLH蛋白，在bHLH結(jié)構(gòu)域中找到了19個保守位點，這19個保守位點可作為bHLH基因的判斷依據(jù)，即如果一個序列含有這19個保守位點的13個及以上，則可認(rèn)為這個蛋白為bHLH蛋白，Toledo-Ortiz等同樣從147個擬南芥bHLH序列中找到了19個保守位點.本研究根據(jù)這19個位點在bHLH結(jié)構(gòu)域中的位置及氨基酸組成特征，從聯(lián)配后的甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子中找到19個相類似的保守位點.這19個保守位點與Atchley等統(tǒng)計的19個位點并不完全相同，在個別位點在結(jié)構(gòu)域中所處的位置有些差異，氨基酸組成也有所不同.但與擬南芥的19個位點相比，甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子19個保守位點的氨基酸組成及所處位置均與其相似.另外，根據(jù)序列聯(lián)配結(jié)果中各位點的氨基酸保守性是否大于50%，從甘薯的比對結(jié)果中找到了21個保守性大于50%的位點，其中有10個位點與上述判斷bHLH蛋白的19個位點相重疊，分別為Glu-13、Arg-14、Arg-16、Leu-27、Lys-36、Leu-44、Ala-47、Ile-48、Tyr-50和Leu-54；擬南芥的相關(guān)研究中同樣也找到了17個保守性在50%以上的位點，其中同樣有10個位點與上述的19個位點相重疊，分別為Glu-13、Arg-14、Arg-16、Leu-27、Lys-39、Leu-46、Ala-49、Ile-50、Tyr-52和Leu-56；從中可以發(fā)現(xiàn)兩者的這10個保守位點氨基酸類型完全相同，但位置上略有差異，這主要是因為bHLH結(jié)構(gòu)域中的Loop區(qū)在不同物種中長度不一，Loop區(qū)的長度范圍約在5～21之間[17].

對甘薯bHLH蛋白構(gòu)建進化樹，根據(jù)Bootstrap值將其分為22個亞組，每個亞組所包含的家族成員個數(shù)有所差異，最多的有20個，最少的僅2個.動物中，根據(jù)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的堿性DNA結(jié)合模式不同,可將bHLH蛋白分為A、B、C、D、E和F 6個組[2]，其中A組和B組都能與E-box結(jié)合，B組中還包括Myc家族；而在植物中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的劃分還未有系統(tǒng)的分類.已知擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子分為21個亞組，其中18亞組家族成員數(shù)最多，有18個，最少的亞組成員有2個.而在167個水稻(Oryzasativa)[19]和159個小麥(TriticumaestivumL.)[23]bHLH轉(zhuǎn)錄因子中，分別被劃分為22和19個亞組.

利用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析了甘薯在尖孢鐮刀菌和低溫脅迫下bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達量變化，分別從中篩選到了6個和44個bHLH家族成員，甘薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子中在低溫脅迫下所響應(yīng)的基因數(shù)遠(yuǎn)多于在尖孢鐮刀菌脅迫下響應(yīng)的基因數(shù)，這可能是因為兩者在不同的逆境條件下的響應(yīng)機制有所不同.