劉 俊， 李 洋， 李海濤， 曾 鮮， 姚 軍*， 袁 潔

(1.烏魯木齊海關(guān)技術(shù)中心，新疆烏魯木齊 830063；2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011；3.天津市理化分析中心，天津 300051；4.新疆醫(yī)科大學(xué)厚博學(xué)院，新疆克拉瑪依 834000)

自然生長(zhǎng)且?guī)в蓄伾拿藁ǚQ為天然彩色棉，主要包括棕色和綠色兩種品系。我國(guó)新疆已成為世界最大的彩棉生產(chǎn)基地，占全國(guó)彩棉總量的95%，占世界彩棉總量的60%[1]。與普通白棉相比，彩棉色澤天然長(zhǎng)成，加工過(guò)程無(wú)需印染，織物不殘留有害化學(xué)物質(zhì)，因而被譽(yù)為 “人類第二健康肌膚”，其紡織品具有廣闊的市場(chǎng)前景。

棉酚(Gossypol)[2,3]是存在于錦葵科植物棉花的根、莖、葉和棉籽仁內(nèi)的一種黃色多酚類化合物，因其結(jié)構(gòu)中含有活性的醛基和羥基而具有毒性。棉酚分子結(jié)構(gòu)中有一個(gè)手性軸，因而存在兩種光學(xué)異構(gòu)體，即左旋棉酚((-)-棉酚)和右旋棉酚((+)-棉酚)，兩者毒性和藥理活性均不相同[4,5]，因此常常需要對(duì)其進(jìn)行拆分檢測(cè)。由于棉酚的化學(xué)毒性，國(guó)家制定了棉籽油和棉粕飼料中棉酚的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[6,7]。目前對(duì)棉酚的檢測(cè)主要集中在棉籽[8,9]、棉籽油[10,11]和棉粕飼料[12,13]等方面，未有對(duì)棉花中游離棉酚對(duì)映體含量的檢測(cè)。棉花作為紡織品原料，與人體皮膚接觸，如果其棉酚含量較高，可能會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康造成潛在的危害。因此，建立一種簡(jiǎn)單、快速的針對(duì)棉花基質(zhì)中棉酚旋光異構(gòu)體的檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究選擇超聲提取法提取棉花基質(zhì)中的棉酚旋光異構(gòu)體，采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定其含量。該方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，精密度好，可用于新疆彩棉中棉酚旋光異構(gòu)體的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；TB-114型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；YZ-250DB超聲波清洗器(上海越眾儀器設(shè)備有限公司)。

(-)-棉酚對(duì)照品(純度>98%)、(+)-棉酚對(duì)照品(純度>98%)均為課題組自制；D -(-)蘇-1-對(duì)硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇(分析純)、甲醇(色譜純)、乙醇(分析純)、磷酸(分析純)均購(gòu)自百靈威科技有限公司。

棉花樣品共12種，其中棕色彩棉5種，綠色彩棉4種，普通白棉3種，依次編號(hào)為1#～12#，均購(gòu)置于中國(guó)彩棉集團(tuán)股份有限公司。

1.2 游離棉酚旋光異構(gòu)體對(duì)照品衍生物溶液的制備[14]

精密稱取(-)-棉酚和(+)-棉酚對(duì)照品各10.0 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加入2%的D -(-)蘇-1-對(duì)硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇和10%冰HAc的N,N-二甲基甲酰胺溶液20 mL，于90 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，用N,N-二甲基甲酰胺定容至刻度，即得400 μg/mL的(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物混合對(duì)照品溶液。

1.3 棉花中棉酚旋光異構(gòu)體供試品溶液的制備

稱取剪碎的棉花樣品1 g，置于研缽中，加入1%的HAc乙醇溶液20 mL，研磨10 min后倒入錐形瓶中，超聲10 min，抽濾，濾液氮吹至2 mL，加入2%的D -(-)蘇-1-對(duì)硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇和10%冰HAc的N,N-二甲基甲酰胺溶液20 mL，置90 ℃下水浴30 min，冷卻至室溫，用N,N-二甲基甲酰胺定容至25 mL棕色容量瓶中，即得。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫20 ℃；流動(dòng)相：甲醇-2%H3PO4溶液(85∶15，V/V)。流速：1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

游離棉酚的極性較弱，本研究發(fā)現(xiàn)乙醇可以有效提取棉籽中的棉酚。由于游離棉酚結(jié)構(gòu)中具有酚羥基，穩(wěn)定性較差，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)游離棉酚在酸性條件下比較穩(wěn)定，因此采用1%的HAc乙醇溶液作為提取溶液，使棉酚的穩(wěn)定性大大提高，能滿足后續(xù)分析測(cè)試的要求。

2.2 棉酚旋光異構(gòu)體拆分方法的選擇

本方法通過(guò)手性拆分試劑與(-)-棉酚和(+)-棉酚反應(yīng)，生成的(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物在ODS柱上可以有效分離。實(shí)驗(yàn)考察了分別采用(R)-(-)-2-胺基-1-丙醇，D -(-)蘇-1-對(duì)硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇和(L)-(-)-2-氨基-3-苯基-1-丙醇對(duì)(±)-棉酚進(jìn)行衍生化反應(yīng)，結(jié)果表明，以D -(-)蘇-1-對(duì)硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇作為手性拆分試劑，在10%冰HAc的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，90 ℃下水浴加熱30 min，衍生化反應(yīng)完全。

2.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

由于棉酚呈現(xiàn)弱酸性，需要在流動(dòng)相中添加弱酸抑制其解離，分別考察了甲醇-2%甲酸溶液和甲醇-2%H3PO4溶液作為流動(dòng)相時(shí)色譜峰的情況，結(jié)果顯示甲醇-2%H3PO4分離效果好。

2.4 專屬性

取質(zhì)量濃度分別為16.0 μg/mL的(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物混合對(duì)照品溶液，及棉酚旋光異構(gòu)體供試品溶液，按“1.4”色譜條件進(jìn)樣分析，得圖1。由圖1可知，對(duì)照品溶液中(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物和棉花供試品中(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物保留時(shí)間分別為22.5 min和12.1 min，其他成分無(wú)干擾。

圖1 游離棉酚旋光異構(gòu)體衍生物的色譜圖Fig.1 Chromatograms of derivatives of free gossypol optical isomersA.Reference substance;B.Sample.1.Derivatives of (+)-gossypol;2.Derivatives of (-)-gossypol.

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 工作曲線精密吸取質(zhì)量濃度為400 μg/mL的(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物混合對(duì)照品溶液5 mL，置于25 mL棕色容量瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶液定容至刻度，經(jīng)逐級(jí)稀釋得質(zhì)量濃度分別為0.128、0.64、3.20、16.0、80.0 μg/mL的棉酚旋光異構(gòu)體衍生物系列溶液，按“1.4”色譜條件進(jìn)樣分析。以濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得(-)-棉酚衍生物回歸方程為:y=52 594x-1 761.9(r=0.9996)；(+)-棉酚衍生物回歸方程為:y=35 839x-6 610.9(r=0.9990)。結(jié)果表明(-)-棉酚衍生物和(+)-棉酚衍生物在0.128～80.0 μg/mL范圍線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度取3.20 μg/mL棉酚光學(xué)異構(gòu)體溶液，按“1.4”色譜條件進(jìn)樣分析，平行測(cè)定6次，(-)-棉酚峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.31%和1.42%，(+)-棉酚峰面積和保留時(shí)間的RSD分別為1.76%和1.63%。表明方法的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性取1#棉花，按“1.3”方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按“1.4”色譜條件進(jìn)樣分析，不同時(shí)間下(-)-棉酚峰面積和(+)-棉酚峰面積的RSD值分別為1.78%和1.46%，保留時(shí)間的RSD值分別為1.63%和1.54%。表明樣品溶液中棉酚旋光異構(gòu)體在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)取1#棉花6份，按“1.3”方法制備供試品溶液，按“1.4”色譜條件進(jìn)樣分析，(-)-棉酚峰面積和(+)-棉酚峰面積的RSD分別為1.94%和1.37%，保留時(shí)間的RSD分別為1.78%和1.48%。

2.5.5 回收率試驗(yàn)取0.5 g的1#棉花樣品9份，每組3份，在每組中分別加入3.20 μg/mL棉酚光學(xué)異構(gòu)體對(duì)照品溶液2、3、4 mL，作為棉酚光學(xué)異構(gòu)體低、中、高樣品組，按“1.3”方法制備供試品溶液，按“1.4” 色譜條件進(jìn)樣分析，數(shù)據(jù)如表1所示。由表1可見檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度較好。

表1 棉酚旋光異構(gòu)體加樣回收率結(jié)果

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用上述方法分析了新疆5種棕色彩棉、4種綠色彩棉及3種白棉中棉酚光學(xué)異構(gòu)體的含量，數(shù)據(jù)如表2所示?？傮w來(lái)看彩棉棉花中棉酚含量比白棉低，(+)-棉酚含量比(-)-棉酚含量低，白棉中棉酚最高含量為84.5 mg/kg，遠(yuǎn)低于棉籽中棉酚含量(1%左右)，也低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中棉籽油中棉酚的限量0.02%。另外由于棉酚屬于極性較小的化合物，難溶于水，隨汗液吸收進(jìn)入人體的量非常有限，因此可以說(shuō)明棉花中微量棉酚不會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康造成影響。

表2 不同品種棉花中棉酚光學(xué)異構(gòu)體含量(mg/kg，n=3)

3 結(jié)論

建立了手性拆分試劑柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定新疆彩棉中棉酚光學(xué)異構(gòu)體的含量，該方法樣品前處理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，精密度好。通過(guò)對(duì)9種新疆彩棉花樣品和3種白棉樣品進(jìn)行棉酚含量測(cè)定，總體來(lái)看彩棉棉花中棉酚含量比白棉低，(+)-棉酚含量比(-)-棉酚含量低，白棉中棉酚最高含量為0.00845%，低于目前棉籽油中棉酚限量為0.02%。