曹 瑋，孫 廣，李小多

(安順市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 安順 561000)

近幾年來，國(guó)內(nèi)耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE)的分離率呈現(xiàn)逐年升高趨勢(shì)。CRE是院內(nèi)感染的主要病原菌，感染后的死亡率可高達(dá)50%[1]。CRE主要包括大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，它們耐藥的機(jī)制主要是能產(chǎn)生水解碳青霉烯類抗菌藥的碳青霉烯酶，即產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌(carbapenemase-producingEnterobacteriaceae，CPE)[2-3]。對(duì)CPE進(jìn)行早期有效地檢出，在疾病的預(yù)防及控制方面具有重要意義。2018版CLSI將改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(modified carbapenem inactivation method，mCIM)納入作為微生物藥敏試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，但是需要的溫育時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)早期檢測(cè)不利[3-5]?；诖?，本研究探討快速碳青霉烯滅活試驗(yàn)(rapid carbapenem inactivation method，rCIM)對(duì)CPE的檢測(cè)性能，以期為臨床提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2018年1月至2020年8月安順市人民醫(yī)院臨床分離得到的90株CRE。采用梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行菌株的鑒定及藥敏試驗(yàn)。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705、ATCC BAA1706均購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器及試劑

梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國(guó)Bio-Merieux公司)；PCR基因擴(kuò)增儀(上海啟步生物科技有限公司)；電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)(成都壹科醫(yī)療器械有限公司)；哥倫比亞血平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；M-H藥敏試驗(yàn)瓊脂平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；亞胺培南西司他丁鈉(杭州默沙東制藥有限公司)；細(xì)菌DNA抽提試劑盒(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；美羅培南藥敏紙片(北京中諾泰安科技有限公司)；PCR試劑盒(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；瓊脂糖(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；DNALadder(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；引物合成和PCR產(chǎn)物測(cè)序(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.3 rCIM檢測(cè)方法

取培養(yǎng)過夜的菌株20 μL，加入到1 mL的無菌水中進(jìn)行渦旋混勻，然后加入2片(20 μg)美羅培南紙片至菌懸液中，渦旋混勻，在35 ℃條件下進(jìn)行0.5 h的溫育。離心(10 000 r·min-1，5 min)后取上清液500 μL，加入到2.5 mL ATCC25922(3×108CFU·mL-1)的TSB培養(yǎng)基菌懸液中，在35 ℃條件下進(jìn)行2 h的孵育，每0.5 h濁度計(jì)數(shù)1次(記錄結(jié)果為減去基線后的濁度增長(zhǎng))。肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705為陽性質(zhì)控菌株，ATCC BAA1706為陰性質(zhì)控菌株。

1.4 mCIM檢測(cè)方法

取培養(yǎng)過夜的菌株1 μL，加入到2 mL的TSB培養(yǎng)基中進(jìn)行渦旋混勻，然后加入1片(10 μg)美羅培南紙片至菌懸液中，渦旋混勻，在35 ℃條件下進(jìn)行4 h的溫育。制備ATCC25922菌懸液(1.5×108CFU·mL-1)，在M-H藥敏試驗(yàn)瓊脂平板上均勻涂布，干燥10 min。用10 μL接種環(huán)取出紙片，擠去多余液體，貼于M-H藥敏試驗(yàn)瓊脂平板，在35 ℃條件下溫育24 h，然后測(cè)量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑為6～15 mm或直徑為16～18 mm，但抑菌圈內(nèi)有針尖樣散在菌落，則結(jié)果判定為陽性，即CPE；抑菌圈直徑為16～18 mm或直徑≥19 mm，但抑菌圈內(nèi)有針尖樣散在菌落，則結(jié)果判定為中介；抑菌圈直徑≥19 mm，則結(jié)果判定為陰性，即非產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌(non-carbapenemase-producingEnterobacteriaceae，NPE)。

1.5 PCR基因檢測(cè)方法

按照細(xì)菌DNA抽提試劑盒說明書操作要求提取細(xì)菌的DNA，對(duì)碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaOXA-48、blaVIM進(jìn)行檢測(cè)，引物序列見表1。反應(yīng)條件：預(yù)變性，94 ℃×5 min；循環(huán)，94 ℃×45 s，55 ℃×45 s，72 ℃×1 min，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)；延伸，72 ℃×10 min。PCR產(chǎn)物采用電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)分析，電壓100 V，1 h。PCR擴(kuò)增陽性結(jié)果測(cè)序后，用NCBI網(wǎng)站中的Blast程序進(jìn)行比對(duì)。

表1 PCR擴(kuò)增檢測(cè)碳青霉烯酶基因的引物序列表

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 rCIM與mCIM篩選CPE的結(jié)果分析

90株CRE中，經(jīng)PCR基因檢測(cè)顯示。CPE 52株，NPE 38株。52株CPE中，肺炎克雷伯菌37株(71.15%)，大腸埃希菌7株(13.46%)，陰溝腸桿菌4株(7.69%)，奇異變形菌與產(chǎn)氣腸桿菌各2株(3.85%)；52株CPE中，30株(57.69%)攜帶blaKPC基因，15株(28.85%)攜帶blaNDM基因，3株(5.77%)攜帶blaNDM+blaIMP基因，2株(3.85%)攜帶blaKPC+blaNDM基因，2株(3.85%)攜帶blaKPC+blaIMP基因。

52株CPE中，rCIM篩選結(jié)果為陽性菌株50株(96.15%)，陰性菌株2株(3.85%)，陰性菌株為奇異變形菌(攜帶blaNDM基因)；mCIM篩選結(jié)果為陽性菌株39株(75.00%)，陰性菌株13株(25.00%)，陰性菌株為7株大腸埃希菌(2株攜帶blaKPC基因、2株攜帶blaNDM基因、3株攜帶blaNDM+blaIMP基因)、2株陰溝腸桿菌(攜帶blaNDM基因)、2株奇異變形菌(攜帶blaNDM基因)、2株產(chǎn)氣腸桿菌(攜帶blaNDM基因)。

2.2 rCIM與mCIM檢測(cè)CPE的價(jià)值比較

以PCR基因檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，rCIM檢測(cè)CPE的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、Kappa值均高于mCIM(均P<0.05)。見表2。

表2 rCIM與mCIM檢測(cè)CPE的價(jià)值比較 n=52

2.3 rCIM與mCIM檢測(cè)時(shí)間及成本的比較

rCIM的初次溫育時(shí)間、二次溫育時(shí)間均明顯短于mCIM(P<0.05)，每株檢測(cè)成本明顯低于mCIM(P<0.05)。見表3。

表3 rCIM與mCIM檢測(cè)時(shí)間及成本的比較

3 討論

CPE的不斷增多已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)院抗感染治療的主要問題。碳青霉烯酶的基因編碼存在于細(xì)菌的多個(gè)基因元件上，若是細(xì)菌的細(xì)胞膜受損時(shí)，細(xì)胞膜的通透性會(huì)增加，碳青霉烯酶能夠在細(xì)菌之間進(jìn)行傳遞，從而導(dǎo)致耐藥細(xì)菌的大量產(chǎn)生并廣泛傳播[6]。因此，快速有效地檢出CPE是臨床需要解決的實(shí)際問題。與PCR等基因檢測(cè)方法相比，表型的檢測(cè)顯得更加便捷及經(jīng)濟(jì)。目前，常見的碳青霉烯酶表型篩選方法主要包括CIM、改良Hodge試驗(yàn)、Carba NP試驗(yàn)等，但是靈敏度較底，且成本較高[7]。mCIM用于碳青霉烯酶表型篩選的靈敏度及特異度均比較高，是2018版CLSI納入的微生物藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究比較rCIM與mCIM對(duì)CPE的檢測(cè)性能，結(jié)果顯示，在52株CPE中，rCIM檢出50株(96.15%)，mCIM檢出39株(75.00%)，rCIM檢測(cè)CPE的敏感度、特異度、一致性Kappa值分別為96.15%、94.76%、0.920，明顯高于mCIM的檢測(cè)效能，但是略低于文獻(xiàn)[8]的報(bào)道，分析可能與本研究菌株的樣本量不夠大有一定關(guān)系。

本研究90株CRE中，PCR基因檢測(cè)檢出52株CPE(57.77%)，其中30株攜帶blaKPC基因，15株攜帶blaNDM基因，說明碳青霉烯酶的產(chǎn)生是本院CRE的主要耐藥機(jī)制，而以KPC、NDM類型的碳青霉烯酶為主[9]。52株CPE中肺炎克雷伯菌37株(71.15%)，大腸埃希菌7株(13.46%)，陰溝腸桿菌4株(7.69%)；37株肺炎克雷伯菌中，28株攜帶blaKPC基因，7株攜帶blaNDM基因，2株攜帶blaKPC+blaIMP基因，說明本院肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制以產(chǎn)KPC類型的碳青霉烯酶為主，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的一致。本研究未檢出攜帶blaOXA-48、blaVIM基因的CPE菌株，這與國(guó)內(nèi)的流行病學(xué)現(xiàn)狀[11]相符。雖然說，PCR、質(zhì)譜等分子生物學(xué)方法是檢測(cè)碳青霉烯酶的金標(biāo)準(zhǔn)，但是操作比較復(fù)雜，成本比較昂貴，且可能會(huì)遺漏不常見基因類型的碳青霉烯酶[12-13]。而rCIM能夠?qū)λ谢蝾愋偷奶记嗝瓜┟高M(jìn)行表型篩選[14]，與mCIM比較，rCIM的檢出時(shí)間、成本費(fèi)用均明顯降低，且不需要特殊的試劑以及設(shè)備。

綜上所述，rCIM作為一種快速且經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，其對(duì)CPE的檢測(cè)性能優(yōu)于mCIM。但是也存在一定的不足，需要納入更大樣本、更加多樣化的菌株進(jìn)行研究，以進(jìn)一步評(píng)估rCIM的臨床價(jià)值。