于 雷，孫 超，張曼旭

人類各種疾病，包括各種代謝性疾病、腸道疾病、癌癥和自身免疫性疾病等均與腸道微生物失調(diào)緊密相關(guān)，其中肝臟疾病的關(guān)聯(lián)性尤為顯著[1]。很多學(xué)者[2，3]研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌、肝硬化和非酒精性脂肪性肝病等患者體內(nèi)存在腸道菌種及其代謝的紊亂狀態(tài)。肝癌作為臨床上高發(fā)性惡性腫瘤之一，不僅嚴(yán)重影響人類的生存質(zhì)量和生命健康，同時(shí)對(duì)社會(huì)和家庭經(jīng)濟(jì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[4]。近幾年來，很多中醫(yī)藥研究機(jī)構(gòu)試圖嘗試研發(fā)輔助藥物以幫助治療肝癌患者，例如靈芝三萜和加味柴苓湯等[5，6]。靈芝多糖(ganoderma lucidum plysaceharide，GLP)是從靈芝中提取的一種主要活性組分。藥理學(xué)研究揭示GLP在調(diào)節(jié)免疫功能、抗癌、抗氧化、抗衰老和抗輻射等方面起著至關(guān)重要的作用[7]。以往研究[8]主要圍繞GLP對(duì)肝癌小鼠腸道粘膜免疫功能的影響或肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響等。本研究采用HepG2細(xì)胞構(gòu)建小鼠肝癌模型，并初步探討了GLP對(duì)其腸道菌群及其菌群代謝功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞、藥品和試劑 SPF級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量為(17.5±2.2)g，購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心(動(dòng)物合格證號(hào)為16054418)。飼養(yǎng)在24～26℃，相對(duì)濕度為53～55%的室內(nèi)，通風(fēng)換氣10次/h，光照12 h，黑暗12 h，自由獲取食物和水；HepG2肝癌細(xì)胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫提供。培養(yǎng)方法：從液氮罐中取出HepG2細(xì)胞、復(fù)蘇，用DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長期時(shí)終止培養(yǎng)，1200 r/m離心10 min，棄去上清液，再用DMEM(含10%胎牛血清)重懸細(xì)胞，制成2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，備用；GLP由西安明澤生物科技股份有限公司提供。益生菌由輝凌公司提供，用前稀釋至50%濃度。精提基因組DNA裂解液：50 mmol/L Tris-HCL、50 mmol/L EDTA、500 mmol/L NaCl、4% EDTA，將pH調(diào)至8.0。應(yīng)用上下游引物(上海生物工程公司)擴(kuò)增細(xì)菌16 s rRNA V3可變區(qū)。

1.2 肝癌小鼠模型的建立 用注射器取上述HepG2細(xì)胞懸液200μL，注射至小鼠右腋下部位，密切觀察小鼠皮下成瘤情況。當(dāng)出現(xiàn)可見瘤體時(shí)，表示造模初步成功。然后，每周測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)直徑。當(dāng)達(dá)到1cm時(shí)，表示造模成功，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本次總共成功構(gòu)建肝癌模型小鼠21只。

1.3干預(yù)與分組 將上述造模成功的肝癌小鼠隨機(jī)分為模型組、GLP組和益生菌組，每組7只。另隨機(jī)選擇7只正常小鼠作為對(duì)照組。GLP和益生菌用量參照臨床上成人的用藥劑量，采取人體-小鼠體表面積比值折算后應(yīng)用2倍量，灌胃；在模型組和對(duì)照組，給予等量的生理鹽水，灌胃，1次/d，連續(xù)干預(yù)2 w。

1.4 小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)檢測(cè) 鏡檢法：采用頸椎或尾椎脫臼法處死小鼠，剝離皮下腫瘤組織，分離小腸，嚴(yán)格按照無菌操作取出一定量的腸道內(nèi)容物，于含有玻璃珠和滅菌蒸餾水的三角瓶內(nèi)，于搖床上120 r/m震蕩30 min，以利于各類微生物充分分散。采用混菌法和涂布法將上述菌液以適宜的稀釋比例接種于相應(yīng)培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h。取出培養(yǎng)液，于顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)腸道內(nèi)容物的菌群豐度。以每克腸道內(nèi)容物含特定類型細(xì)菌數(shù)表示，每個(gè)稀釋度重復(fù)檢測(cè)3次；變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)：取小鼠糞便，置于干凈的2 mL無菌EP管中，添加一定量的鎬珠，加入精提基因組DNA裂解液700μL，吹打、充分混勻，再將苯酚/氯仿/異戊醇以25/24/1比例加入250μL并混勻。在旋渦震蕩儀上震蕩3 min，12000 r/m離心5 min，取上清于新的無菌EP管中，加入10 mol/L乙酸銨700μL，冰上放置5 min，12000 r/m離心10 min，取上清并再次用苯酚/氯仿/異戊醇抽提2次，氯仿抽提2次，再加入異丙醇并置于-20℃冰箱30 min，使DNA沉淀。離心并棄掉上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，最后用雙蒸水50μL溶解DNA，備用；PCR擴(kuò)增16 s rRNA V3可變區(qū)。PCR反應(yīng)體系：Taq DNA聚合酶12.5μL、10μM F 0.5μL、10μM R 0.5μL、DNA模板1.0μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件采用Touch down程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸70 s，共20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度依次降低0.5℃，溫度遞降范圍為65～56℃，最后以56℃退火溫度循環(huán)10次；配制濃度為8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度范圍為30%～58%。將上述DNA擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，并置于1×TAE緩沖液中電泳，電泳條件：電壓220 v，預(yù)電泳5 min，60℃、電壓85 v電泳16 h；硝酸銀染色、拍照，應(yīng)用Quantity One軟件分析；DGGE指紋圖譜分析。應(yīng)用相似性聚類分析法將DGGE膠通過掃描儀輸入到電腦，再應(yīng)用Molecular Analysis軟件分析各細(xì)菌序列相似性，每一個(gè)條帶表示特定菌種，然后通過序列比對(duì)分析和計(jì)算得出菌種豐富度、多樣性指數(shù)和均勻度。

1.5 小鼠腸道菌群脂肪酸代謝產(chǎn)物檢測(cè) 于干預(yù)后2 w收集各組小鼠糞便，采用氣相色譜法檢測(cè)短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、正丁酸)水平；采用Megazyme D-乳酸定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定D-乳酸含量。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠腸道菌群比較 GLP處理組和益生菌處理組小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌和腸球菌數(shù)量顯著低于模型組(P<0.05)；模型組小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌和腸球菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；但GLP處理組和益生菌處理組小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌和腸球菌數(shù)量與對(duì)照組基本一致(P>0.05，表1)。

表1 四組小鼠腸道菌群比較

2.2 四組小鼠糞便DGGE圖譜指標(biāo)比較 GLP處理組和益生菌處理組小鼠腸道菌群豐富度、多樣性指數(shù)和均勻度較顯著高于模型組(P<0.05)；模型組小鼠腸道菌群豐富度、多樣性指數(shù)和均勻度均顯著低于對(duì)照組(P<0.05，表2)。

表2 四組小鼠糞便DGGE圖譜指標(biāo)比較

2.3 四組小鼠菌群代謝功能指標(biāo)比較 GLP組、益生菌組小鼠腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、正丁酸均顯著高于模型組(P<0.05)，D-乳酸顯著低于模型組(P<0.05)；模型組乙酸、丙酸、正丁酸均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，D-乳酸顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；GLP組、益生菌組小鼠腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、正丁酸、D-乳酸與對(duì)照組基本一致(P>0.05，表3)。

表3 四組小鼠腸道菌群代謝產(chǎn)物水平比較

3 討論

腸道菌群失調(diào)指的是腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈的改變，益生菌數(shù)量急劇下降，同時(shí)伴隨有害細(xì)菌的肆意滋生，使腸道代謝功能紊亂[9-11]。本研究結(jié)果顯示，肝癌模型小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌和腸球菌數(shù)量較對(duì)照組均顯著升高，表明肝癌的形成改變了小鼠腸道菌群的種類和數(shù)量。在干預(yù)后，GLP組和益生菌處理組小鼠腸道上述菌群數(shù)量較模型組均顯著減少，且接近對(duì)照組水平，表明GLP干預(yù)可以降低肝癌小鼠體內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌和腸球菌數(shù)量，有利于維持腸道菌群的平衡。益生菌是目前臨床上廣泛使用的有益活性微生物，可用于改善腸道功能，幫助營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[12-16]。DGGE分析結(jié)果顯示GLP處理組和益生菌處理組小鼠腸道菌群豐富度、多樣性指數(shù)和均勻度較模型組均顯著升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了GLP參與調(diào)控肝癌小鼠腸道的微生態(tài)失衡，其作用與益生菌相當(dāng)。

短鏈脂肪酸，諸如乙酸、丙酸和正丁酸，為機(jī)體腸道菌群獨(dú)有的經(jīng)典重要代謝產(chǎn)物，這些指標(biāo)可以從側(cè)面揭示腸道內(nèi)厭氧性菌群代謝的功能狀態(tài)[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GLP處理組和益生菌處理組腸道乙酸、丙酸、正丁酸水平較模型組均顯著升高，且接近對(duì)照組小鼠水平，表明GLP干預(yù)有利于肝癌小鼠腸道菌群代謝功能的恢復(fù)，改善機(jī)體代謝紊亂狀態(tài)，其機(jī)制與調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群平衡密切相關(guān)[18]。D-乳酸是衡量腸道菌群增殖能力的指標(biāo)，可用于指示腸道細(xì)菌增殖程度[19]。GLP處理組和益生菌處理組腸道D-乳酸較模型組均顯著降低，表明GLP和益生菌處理均能夠降低與D-乳酸代謝相關(guān)的有害細(xì)菌增殖，其機(jī)制可能與調(diào)控腸道內(nèi)酸堿度、調(diào)控腸道粘膜免疫相關(guān)分子水平和抑制酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[20]。