田安然，徐瑞瑞，胡平平，李毓雯，朱傳龍

延伸因子結(jié)合蛋白2(elongation factor Tu GTP-binding domain-containing 2，EFTUD2)是一種剪接體GTP酶，參與機(jī)體許多重要的生物學(xué)過(guò)程，例如針對(duì)肝炎病毒入侵時(shí)的先天免疫應(yīng)答[1,2]、癌癥的發(fā)生[3,4]、神經(jīng)發(fā)育[5]、細(xì)胞的成熟分化[6]和顱面畸形[7,8]等。EFTUD2在肝炎病毒感染過(guò)程中發(fā)揮不可或缺的調(diào)控作用。然而，針對(duì)EFTUD2的靶向細(xì)胞模型還較少。因此，本研究旨在利用HepG2細(xì)胞構(gòu)建以EFTUD2為靶點(diǎn)的化合物篩選細(xì)胞模型，不僅為后續(xù)篩選可上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物奠定研究基礎(chǔ)，而且也為開發(fā)治療慢性乙型肝炎新型藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 HepG2細(xì)胞株由哈佛大學(xué)Wenyu Lin教授提供。LV6載體、pGag/Pol、pRev、pVSV-G質(zhì)粒(上海吉瑪基因股份有限公司)；高純度質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(天根生化)；中量質(zhì)粒抽提試劑盒(杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)；XbaI和BamHI DNA內(nèi)切酶(加拿大MBI Fermentas公司)；嘌呤霉素(生工)；青霉素和鏈霉素(上海碧云天生物有限公司)；Polybrene(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)promega公司)；ClonExpress? Entry One Step Cloning Kit(南京諾唯贊生物科技有限公司)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)。AIRTECH 超凈工作臺(tái)(蘇州安泰公司)；GloMaxTM20/20 發(fā)光檢測(cè)儀，GloMaxTM96 微孔板發(fā)光檢測(cè)儀(美國(guó)promega公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取HepG2細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，常規(guī)加入抗生素(青霉素100 u/ml，鏈霉素0.1 mg/ml)。細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5% CO2。當(dāng)單層貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)密度約80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 LV6慢病毒載體構(gòu)建和包裝 LV6載體含有EF-1a啟動(dòng)子，嘌呤霉素篩選標(biāo)記，無(wú)熒光標(biāo)簽。通過(guò)融合PCR技術(shù)將hEFTUD2pro-0.5kb基因片段和來(lái)自LV17載體的熒光素酶基因片段組成目的片段Epro0.5-LUC。在37℃恒溫下，用XbaI和BamHI DNA內(nèi)切酶酶切LV6載體2 h。隨后，對(duì)酶切條帶用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，并回收LV6載體條帶。將回收好的Epro0.5-LUC目的片段利用克隆試劑盒重組到線性化的LV6載體中，構(gòu)建成LV6-Epro0.5-LUC穿梭質(zhì)粒。配置好反應(yīng)體系并混勻(5 × CE Entry緩沖液4 μl；LV6載體1 μl；Epro0.5-LUC 2 μl；Exnase Entry 2 μl；DEPC水11 μl)，于37℃環(huán)境下反應(yīng)30 min。在反應(yīng)結(jié)束后，迅速取出反應(yīng)管，轉(zhuǎn)移到低溫水浴中，冷卻后置4℃冰箱備用。待293T細(xì)胞生長(zhǎng)較好時(shí)，用胰酶消化離心，用完全培養(yǎng)基重懸并接種到15 cm培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為70%～80%。重組慢病毒穿梭質(zhì)粒LV6-Epro0.5-LUC，與包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev和pVSV-G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞72 h，收集病毒液并進(jìn)行滴度檢測(cè)。

1.4 嘌呤霉素藥物篩選濃度的確定 按照5×104細(xì)胞/孔，將HepG2細(xì)胞接種于24孔板，每孔液體總量為500μl，均勻鋪板后，于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。每孔加入嘌呤霉素，終濃度分別為0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3和2.4 μg/ml。維持嘌呤霉素濃度培養(yǎng)細(xì)胞，并根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)適時(shí)換液，連續(xù)觀察6 d，選擇能在6 d內(nèi)完全殺死細(xì)胞的最低濃度作為嘌呤霉素的工作濃度。

1.5 感染慢病毒構(gòu)建細(xì)胞模型及其篩選 對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照1×104細(xì)胞/孔將HepG2細(xì)胞接種于48孔板，在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，進(jìn)行慢病毒感染。每孔加入5 μg/mL 的 Polybrene，對(duì)病毒原液按照MOI值100感染HepG2細(xì)胞，8 h后更換新鮮含10% FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。再將每孔的培養(yǎng)基更換成含嘌呤霉素的選擇性培養(yǎng)基(含1.0μg/ml嘌呤霉素)，每隔2～3 d換液一次，維持嘌呤霉素濃度在選擇壓力下持續(xù)培養(yǎng)2 w左右。

1.6 單克隆細(xì)胞的獲取 成功感染病毒細(xì)胞能夠繼續(xù)存活，待長(zhǎng)出多克隆細(xì)胞后，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。選擇熒光素酶活性較強(qiáng)的細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。將擴(kuò)大培養(yǎng)的多克隆細(xì)胞株消化離心，制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞數(shù)調(diào)制為5000細(xì)胞/ml，再逐級(jí)稀釋成1000細(xì)胞/ml、100細(xì)胞/ml、50細(xì)胞/ml、20細(xì)胞/ml、10細(xì)胞/ml和5細(xì)胞/ml。按不同細(xì)胞數(shù)梯度分別接種96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100μl，使每孔含有一個(gè)細(xì)胞，維持嘌呤霉素濃度不變。待細(xì)胞貼壁后，在顯微鏡下觀察并將含有單個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔進(jìn)行標(biāo)記，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待長(zhǎng)出單克隆細(xì)胞株后(約15～20 d)，挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的5株細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序檢驗(yàn)，并留取適量相應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)。選擇測(cè)序結(jié)果正確且熒光讀值最高的細(xì)胞株繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。同時(shí)，維持嘌呤霉素濃度。篩選出具有正常細(xì)胞周期且能穩(wěn)定傳代20代以上的單克隆細(xì)胞株，大量?jī)龃?，將獲得的細(xì)胞命名為Epro-LUC-HepG2細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 LV6-Epro0.5-LUC慢病毒載體構(gòu)建成功 通過(guò)融合PCR技術(shù)，將前期實(shí)驗(yàn)篩選出的具有最強(qiáng)啟動(dòng)活性的hEFTUD2pro-0.5kb啟動(dòng)子序列與螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因整合成融合基因，通過(guò)限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI雙酶切將融合基因同源重組進(jìn)LV6載體中，構(gòu)建LV6-Epro0.5-LUC穿梭質(zhì)粒。酶切穿梭質(zhì)粒并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，經(jīng)測(cè)序比對(duì)，驗(yàn)證正確無(wú)誤后，與包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒包裝并進(jìn)行滴度檢測(cè)。LV6-Epro0.5-LUC載體圖譜見圖1。利用瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序鑒定重組慢病毒載體(圖2、圖3)，將成功獲得的慢病毒命名為L(zhǎng)V6-Epro0.5-LUC慢病毒。

圖1 LV6-Epro0.5-LUC載體圖譜

圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定LV6-Epro0.5-LUC重組載體 采用Xba I和BamH I雙酶切構(gòu)建LV6-Epro0.5-LUC重組載體，在Epro0.5-LUC融合基因中存在一個(gè)BamH I酶切位點(diǎn)，在雙酶切重組載體進(jìn)行電泳鑒定時(shí)，產(chǎn)生了3個(gè)酶切條帶

圖3 測(cè)序鑒定重組LV6-Epro0.5-LUC載體

2.2 嘌呤霉素藥物篩選濃度的確定結(jié)果 在HepG2細(xì)胞，摸索嘌呤霉素藥物篩選濃度，連續(xù)觀察6 d加入嘌呤霉素培養(yǎng)的細(xì)胞并拍照記錄(圖4)，能在6 d內(nèi)完全殺死細(xì)胞的最低濃度被確定為1.0 μg/ml，并以該濃度作為后續(xù)單克隆細(xì)胞篩選時(shí)所用的嘌呤霉素的濃度。

圖4 嘌呤霉素致死濃度的篩選

2.3 獲得Epro-LUC-HepG2單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 在LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2細(xì)胞，感染后8 h更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入終濃度為1.0μg/ml的嘌呤霉素進(jìn)行藥物篩選。維持藥物選擇壓力持續(xù)培養(yǎng)2 w左右，用長(zhǎng)出的多克隆細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法挑選出5株單克隆細(xì)胞株。對(duì)5株細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證目的序列是否克隆入細(xì)胞基因組，并利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)5株單克隆細(xì)胞株的熒光素酶活性，選擇熒光素酶活性最高的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)(圖5)，結(jié)果成功建立了單克隆細(xì)胞模型，將其命名為Epro-LUC-HepG2細(xì)胞。

圖5 各克隆細(xì)胞株的熒光素酶活性的比較 在挑出的5株單克隆細(xì)胞中，第4株細(xì)胞生長(zhǎng)狀況較差，被棄用

3 討論

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種嗜肝DNA病毒。HBV不直接殺死被感染的肝細(xì)胞。當(dāng)它被識(shí)別為外來(lái)抗原時(shí)，宿主免疫系統(tǒng)就會(huì)鎖定并破壞受感染的肝細(xì)胞，從而導(dǎo)致肝組織的炎癥和壞死[9]。慢性HBV感染是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織在2015年估計(jì)，約有2.57億人(全球人口的3.5%)慢性感染HBV，其中大多數(shù)人群出生于廣泛使用乙肝疫苗之前。除此之外，長(zhǎng)期感染HBV可導(dǎo)致肝臟纖維化和硬化，進(jìn)一步會(huì)引起25%～40%HBV攜帶者發(fā)生失代償期肝病和/或肝細(xì)胞癌[10]。

傳統(tǒng)的治療HBV感染的藥物主要是核苷(酸)類似物和干擾素-α(IFN-α)[11]。前者主要是靶向在干擾HBV生命周期中的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程而發(fā)揮作用，其優(yōu)點(diǎn)是良好的耐受性和強(qiáng)效的抗病毒活性[12]。但是，它們不能完全抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA合成[13]。細(xì)胞因子介導(dǎo)的治療例如IFN-α，能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，通過(guò)誘導(dǎo)各種干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes，ISGs)表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗病毒作用。有研究提示聚乙二醇化干擾素的使用會(huì)產(chǎn)生較多的副作用，比如流感樣綜合征、體質(zhì)量減輕、中性粒細(xì)胞減少和血小板減少等，可能增加感染和出血風(fēng)險(xiǎn)。因此，被禁用于晚期肝病以及出現(xiàn)白細(xì)胞減少和嚴(yán)重血小板減少的患者[14]。所以，要根據(jù)患者的基本情況來(lái)考慮是否進(jìn)行IFN-α治療，也使IFN-α的應(yīng)用受到一定的限制。因此，迫切需要更加安全、有效、便捷的治療方法，讓盡可能多的慢性乙型肝炎患者受益。

U5小核糖核蛋白是剪接體激活的關(guān)鍵部分，而EFTUD2是U5小核糖核蛋白的核心成分，它屬于一種GTP酶，能夠與GTP/GDP結(jié)合[15-17]，這一特性對(duì)于維持剪接體的正常功能至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)EFTUD2基因是肝細(xì)胞癌患者的一個(gè)預(yù)后獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，其表達(dá)水平較高的患者總體生存時(shí)間和腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間明顯較短[4]。本課題組前期的研究已經(jīng)證明EFTUD2在丙型肝炎病毒感染過(guò)程中能夠發(fā)揮抗病毒作用，主要通過(guò)其pre-mRNA剪切作用來(lái)調(diào)控下游的調(diào)節(jié)因子，例如視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I和黑色素瘤分化相關(guān)基因5，進(jìn)而激活干擾素調(diào)節(jié)因子3，促進(jìn)ISGs的表達(dá)[2]。所以，EFTUD2基因在機(jī)體對(duì)抗肝炎病毒感染過(guò)程中具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)其進(jìn)行多方面的深入研究將為治療病毒性肝炎提供更多思路和選擇。

人類原代肝細(xì)胞是HBV復(fù)制研究的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，由于人肝臟組織的來(lái)源有限和存在遺傳多樣性，并且這類細(xì)胞容易喪失其本身特性和持續(xù)支持HBV復(fù)制的能力，使得該細(xì)胞模型的有效性和可用性受到了不少限制[18,19]。HepG2細(xì)胞是一種人肝癌細(xì)胞系，最初來(lái)源于一名15歲男性高分化肝癌患者[20]，它在感染HBV后能夠支持HBV的復(fù)制。因此，是HBV相關(guān)研究較為理想的細(xì)胞系。除了在病毒性肝炎研究領(lǐng)域被廣泛使用外，HepG2細(xì)胞已經(jīng)被成熟應(yīng)用于藥物的毒性試驗(yàn)、自噬損傷和細(xì)胞代謝通路等其他方面的研究。此外，由HepG2衍生而來(lái)的細(xì)胞，如HepG2.2.15和HepG2-NTCP細(xì)胞也在各種病毒性肝炎研究中得到廣泛使用。

本研究根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇具有較強(qiáng)啟動(dòng)活性的hEFTUD2pro-0.5kb啟動(dòng)子片段，通過(guò)構(gòu)建含有目的啟動(dòng)子片段和Luciferase基因片段的慢病毒載體，將兩種基因片段克隆入HepG2細(xì)胞基因組，篩選出陽(yáng)性克隆株并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。由于LV6重組載體中插入了Luciferase基因片段，因此能夠利用熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶基因的表達(dá)，從而可以間接地反映該啟動(dòng)子片段是否能夠有效啟動(dòng)EFTUD2基因表達(dá)。該細(xì)胞系含有人EFTUD2基因啟動(dòng)子片段，更加便于后續(xù)尋找能夠上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物的研究。