薛 秋

(江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院普外科，南通 226361)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五大常見(jiàn)腫瘤，發(fā)病率高且預(yù)后較差。除少部分患者適于手術(shù)切除、肝動(dòng)脈化療栓塞、射頻消融和肝移植等治療外，大部分患者的治療效果和預(yù)后均不理想。經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)在世界范圍內(nèi)被用于治療中期HCC 患者，主要適用于腫瘤巨大且多發(fā)、不能手術(shù)切除的肝功能正?；颊遊1]。TACE 通過(guò)導(dǎo)管將化療藥物打到腫瘤主要供血血管內(nèi)，達(dá)到控制腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞減滅作用。然而隨著治療次數(shù)和時(shí)間的延長(zhǎng)，5 年生存率僅7.5%，且易發(fā)生肝內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移[2]。原癌基因的激活或高表達(dá)和抑癌基因的失活是使正常細(xì)胞走向惡化的根本原因。因此，靶向癌基因驅(qū)動(dòng)的精確癌癥治療策略一直是現(xiàn)今的研究熱點(diǎn)[3]。

叉頭框(forkhead box,Fox)家族包含多種組織和細(xì)胞類型的特異性轉(zhuǎn)錄因子，具有保守的翼狀螺旋DNA 結(jié)合域(DNA binding domain,DBD)或叉頭結(jié)構(gòu)域。Fox 轉(zhuǎn)錄因子家族成員通常被認(rèn)為是胚胎發(fā)生和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)過(guò)程中生理發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。自第1 個(gè)Fox 基因被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，根據(jù)蛋白質(zhì)序列同源性(FoxA～FoxS)，人類50 個(gè)Fox 編碼基因被分為19個(gè)亞家族[4]。盡管Fox 轉(zhuǎn)錄因子的每個(gè)亞家族都具有重要的生物學(xué)意義，但FoxA、FoxM1、FoxO、FoxC 和FoxP 受到廣泛關(guān)注，尤其在癌癥研究中。FoxM1 目前被認(rèn)為是多種癌癥的重要調(diào)節(jié)因子，其過(guò)度表達(dá)對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥具有重要意義。FoxM1 的過(guò)度表達(dá)在癌癥中很常見(jiàn)，其高表達(dá)與患者的生存率差有關(guān)[5]。為探討FoxM1 在HCC 中的表達(dá)及其在TACE 治療中的評(píng)估價(jià)值，本研究探討了FoxM1 的表達(dá)水平對(duì)HCC 患者TACE 治療反應(yīng)性及預(yù)后的關(guān)系，為FoxM1 作為判斷HCC 患者TACE 治療后腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后的預(yù)測(cè)因子提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2011 年1 月—2014 年12 月南通市腫瘤醫(yī)院標(biāo)本庫(kù)中的HCC 標(biāo)本共114 例，其中男91 例，女23 例；年齡21～75 歲，中位年齡49.28歲。入選條件：(1)術(shù)前均未行放、化療和手術(shù)治療；(2)無(wú)介入治療禁忌證；(3)未合并其他惡性腫瘤及嚴(yán)重內(nèi)科疾病，一般狀況良好。收集患者臨床信息如年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、TNM 分期、腫瘤數(shù)目、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤包膜是否完整、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、是否乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)表達(dá)情況、肝纖維化水平、是否門靜脈侵犯等。

1.2 治療方法 行根治性手術(shù)切除，手術(shù)切緣>2 cm。癌及癌旁組織標(biāo)本經(jīng)手術(shù)切除后裝凍存管置液氮保存?zhèn)溆?。?jīng)病理證實(shí)為HCC 患者，術(shù)后1 個(gè)月開(kāi)始行常規(guī)2～4 次輔助性TACE 治療，操作過(guò)程按照TACE 技術(shù)操作規(guī)范執(zhí)行。化療方案：順鉑(65 mg/m2)為基礎(chǔ)的化療方案，每4 周重復(fù)1 次。本研究經(jīng)南通大學(xué)倫理委員會(huì)及南通市腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。治療前均經(jīng)患者和家屬充分知情同意，并簽署知情同意書(shū)，無(wú)手術(shù)及化療禁忌證。

2015—2017年參加湖北省小麥區(qū)域試驗(yàn)，兩年平均產(chǎn)量為 5 909.85 kg／hm2，較對(duì)照鄭麥 9023 增產(chǎn)5.19%。 其中 2015—2016 年平均產(chǎn)量為 6 455.40 kg／hm2， 較對(duì)照增產(chǎn) 7.27%， 增產(chǎn)極顯著；2016—2017 年平均產(chǎn)量為 5 364.30 kg／hm2，較對(duì)照增產(chǎn)2.81%，增產(chǎn)顯著。

將復(fù)染后的石蠟切片進(jìn)行掃描，將所得到的切片光密度值進(jìn)行測(cè)量和統(tǒng)計(jì)，在114 例HCC 病例中，F(xiàn)oxM1 高表達(dá)75 例(65.79%)(FoxM1 高表達(dá)組)，F(xiàn)oxM1 低或不表達(dá)39 例(34.21%)(FoxM1 低/不表達(dá)組)。FoxM1 高表達(dá)組癌中FoxM1 的表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.001,圖2A)；而在FoxM1 低/不表達(dá)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.097 8,圖2B)；FoxM1 表達(dá)水平=癌中FoxM1 表達(dá)值/癌旁FoxM1 表達(dá)值，發(fā)現(xiàn)FoxM1 高表達(dá)組的FoxM1 表達(dá)水平明顯高于FoxM1 低/不表達(dá)組(P<0.001,圖2C)。

2.1 FoxM1 在HCC 患者癌及癌旁組織中的表達(dá)收集所有HCC 癌及癌旁組織石蠟樣本進(jìn)行FoxM1免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示FoxM1 在癌組織中呈深褐色染色，主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(圖1)。

2.3 FoxM1 高表達(dá)對(duì)HCC 患者行根治性手術(shù)切除聯(lián)合TACE 治療后DFS 的影響 隨訪HCC 患者5年的DFS，單因素回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者5 年的DFS 與性別、年齡、腫瘤的分化程度、腫瘤包膜是否完整、脈管是否受侵犯沒(méi)有顯著關(guān)系，但與患者的腫瘤大小、TNM 分期、肝內(nèi)腫瘤數(shù)目、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HBV 感染情況，AFP 表達(dá)水平，肝硬化程度，F(xiàn)oxM1 高表達(dá)間顯著相關(guān)(表2)。

設(shè)計(jì)了橋梁高速施工中大跨徑連續(xù)施工技術(shù)，首先通過(guò)正向分析法，對(duì)大跨徑橋梁進(jìn)行正向分析，對(duì)橋梁評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行實(shí)時(shí)獲取。然后建立橋梁高速施工控制策略并進(jìn)行控制計(jì)算，明確控制參數(shù)結(jié)果。最后實(shí)行施工監(jiān)測(cè)，保證施工數(shù)據(jù)和理論數(shù)據(jù)相一致，實(shí)現(xiàn)橋梁大跨徑連續(xù)高速施工。實(shí)驗(yàn)證明，設(shè)計(jì)的大跨徑連續(xù)施工技術(shù)施工精確度和施工效率更高，具有推廣價(jià)值。

2 結(jié) 果

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)切片在400 倍光鏡下觀察，每張切片觀察5 個(gè)高倍視野，采用IPWIN60 軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)量FoxM1 表達(dá)的光密度值。根據(jù)著色的深淺進(jìn)行評(píng)分：FoxM1 陰性，細(xì)胞不著色，記0 分；弱陽(yáng)性，細(xì)胞呈淡黃色，記1 分；陽(yáng)性，細(xì)胞呈棕黃色，記2 分；強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞呈深棕黃色，記3 分。標(biāo)志物敏感性評(píng)價(jià)：++～+++為陽(yáng)性，0～+為陰性。

周肇祥《琉璃廠雜記》中有一節(jié)記：“北漢劉銖用法刻深，民有過(guò)者，問(wèn)其年幾何，對(duì)以若干，即隨其數(shù)杖之，謂之隨年杖?！蔽液闷?，怕是傳說(shuō)，查了一下，原來(lái)這一段出自《新五代史》，確有其事。據(jù)記這位劉大人曾做過(guò)開(kāi)封府尹，當(dāng)年不知有多少人被他這隨年杖打怕了？

1.3 免疫組織化學(xué) 實(shí)驗(yàn)步驟按GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；將切片浸泡在枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)中，95～100 ℃抗原修復(fù)20 min；中性磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered solution,PBS)洗3 次，5 min/次；3%H2O2避光孵育15 min；PBS 洗3 次，5 min/次；室溫下免疫染色封閉液孵育1 h；FoxM1一抗(兔抗，1∶100 稀釋)，室溫孵育1 h；PBS 洗3 次，5 min/次；滴加標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)和抗兔免疫球蛋白的多聚體分子二抗(GTVisionTMⅢ型，A 液)于切片上，常溫孵育1 h；PBS 洗3 次，5 min/次；滴加顯色劑3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)工作液，室溫孵育5～10 min，或光鏡下控制顯色；蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染20 min；鹽酸乙醇分色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，封片膠封片。

圖2 FoxM1 在HCC 癌中和癌旁組織的表達(dá)情況

進(jìn)一步多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，患者的5 年DFS與肝內(nèi)腫瘤數(shù)目、FoxM1 高表達(dá)顯著相關(guān)，與其他因素?zé)o關(guān)(表2)。術(shù)后臨床資料分析發(fā)現(xiàn)FoxM1 與肝內(nèi)腫瘤數(shù)目顯著相關(guān)(表1)，由此可見(jiàn)FoxM1 高表達(dá)可作為影響HCC 患者治療效果和評(píng)估患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)后影響因素。

表1 HCC 患者FoxM1 表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性

在農(nóng)村，上大學(xué)，找個(gè)體面工作，是許多普通農(nóng)家的期望，但是河南省正陽(yáng)縣慎水鄉(xiāng)臺(tái)天村民兵連基干民兵牛超，卻選擇了回鄉(xiāng)創(chuàng)業(yè)。

2.2 HCC 患者FoxM1 表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性 本研究采集了根治性手術(shù)切除后行TACE 治療的114 例HCC 患者的基本信息，包括性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、肝內(nèi)腫瘤個(gè)數(shù)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，包膜是否完整、有無(wú)血管侵犯、TNM 分期、AFP 水平、HBV 感染、肝硬化等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FoxM1高表達(dá)與肝內(nèi)腫瘤數(shù)目顯著相關(guān)(χ2=8.050,P=0.005)，與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤的分化程度、腫瘤的TNM 分期、AFP 表達(dá)水平、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤包膜是否完整、HBV 感染情況、肝硬化程度、脈管是否受侵犯均無(wú)關(guān)(均P>0.05)(表1)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。組內(nèi)比較采用Wilcoxon non-parametric signed-rank 檢驗(yàn)，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。FoxM1 的表達(dá)水平與患者的一般臨床資料采用χ2檢驗(yàn)。無(wú)病生存期(disease free survival,DFS)從手術(shù)日期至影像學(xué)上再次發(fā)現(xiàn)HCC 復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、或末次隨訪日期計(jì)算。單因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸進(jìn)行患者5 年的DFS 生存分析，單因素回歸分析中的顯著因素進(jìn)一步納入多因素回歸分析。FoxM1 高表達(dá)與FoxM1低/不表達(dá)患者的DFS 兩兩比較采用Kaplan-Meier survival 分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 影響HCC 患者行根治性手術(shù)切除聯(lián)合TACE 治療后DFS 的因素分析

Kaplane-Meier 生存分析患者行根治性手術(shù)切除聯(lián)合TACE 治療后的DFS，將FoxM1 高表達(dá)與FoxM1 低/不表達(dá)患者的DFS 進(jìn)行兩兩比較：其中位生存時(shí)間為18 個(gè)月vs 27 個(gè)月，F(xiàn)oxM1 高表達(dá)患者DFS 顯著低于FoxM1 低/不表達(dá)患者(Log-rank test=4.949,P=0.026,圖3)，說(shuō)明FoxM1 的高表達(dá)降低了HCC 患者的DFS，由此說(shuō)明FoxM1 的表達(dá)水平是影響HCC 患者術(shù)后輔助性介入治療效果的獨(dú)立影響因素。

(三)在財(cái)政層面，監(jiān)管不到位，由于非稅局人員力量薄弱，沒(méi)有將“征、管、查”有效地結(jié)合起來(lái)，使得非稅監(jiān)管工作開(kāi)展不到位。同時(shí)，受到財(cái)力分成的負(fù)面作用影響，對(duì)非稅收入往往并不是應(yīng)繳盡繳，而是會(huì)視財(cái)政調(diào)度收入進(jìn)度情況和本鎮(zhèn)街收入完成情況酌情上繳，造成人為調(diào)節(jié)收入的現(xiàn)象。

圖3 FoxM1 的表達(dá)水平對(duì)HCC 患者TACE 治療后DFS 的影響

3 討 論

Fox 基因家族是2000 年統(tǒng)一命名的一大類功能各異的“翼螺旋”轉(zhuǎn)錄因子。FoxM1 是Fox 轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，與細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育、衰老、再生和腫瘤等許多病理生理過(guò)程密切相關(guān)。FoxM1 信號(hào)在細(xì)胞發(fā)育途徑中起重要作用，包括維持細(xì)胞增殖和凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡，因此FoxM1 基因的非正常激活已成為癌變組織的重要特征之一。研究[6]表明，F(xiàn)oxM1 增強(qiáng)了小鼠鼻咽癌細(xì)胞系的致瘤能力，促進(jìn)了腫瘤的增殖、細(xì)胞周期的進(jìn)展、遷移和應(yīng)力纖維的形成，提示FoxM1 能顯著誘導(dǎo)鼻咽癌的進(jìn)展和腫瘤干細(xì)胞特征。通過(guò)miR-216b 靶向抑制FoxM1，可以抑制裸鼠體內(nèi)黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而miR-216b過(guò)度表達(dá)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響被FoxM1 過(guò)度表達(dá)逆轉(zhuǎn)[7]。FoxM1 在許多人類癌癥中過(guò)度表達(dá)，特別是乳腺癌，與靶向治療和化療的耐藥性密切相關(guān)，抑制FoxM1 轉(zhuǎn)錄因子功能已經(jīng)成為克服乳腺癌進(jìn)展的一種潛在策略[8]。

艾劍剛等[9]發(fā)現(xiàn)，HCC 患者癌組織中FoxM1 蛋白表達(dá)水平與組織和血清中AFP 表達(dá)水平呈正相關(guān)，下調(diào)FoxM1 表達(dá)可明顯抑制HepG2 和HepG2.2.15細(xì)胞分泌AFP，而過(guò)表達(dá)FoxM1 可明顯促進(jìn)HepG2和HepG2.2.15 細(xì)胞表達(dá)和分泌AFP，提示HCC 中FoxM1 可能在促進(jìn)AFP 表達(dá)中發(fā)揮重要作用。高表達(dá)的FoxM1 對(duì)多種化療藥物有直接或間接抵抗作用，如蒽環(huán)類的表阿霉素、順鉑、他莫昔芬、赫塞汀、吉非替尼等[10]。最近研究[11]發(fā)現(xiàn)通過(guò)microRNAs 抑制FoxM1 的表達(dá)能夠提高肝癌細(xì)胞株對(duì)紫杉醇的藥物敏感性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。作為重要的分子腫瘤標(biāo)志物，F(xiàn)oxM1 的表達(dá)水平可用于預(yù)測(cè)肝癌患者肝移植的預(yù)后，F(xiàn)oxM1 低表達(dá)患者術(shù)后的無(wú)復(fù)發(fā)生存期和總生存期明顯高于FoxM1 高表達(dá)患者[12]，可見(jiàn)FoxM1 高表達(dá)能使肝腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，影響患者的預(yù)后，但FoxM1 的表達(dá)與HCC 患者行根治性手術(shù)切除聯(lián)合TACE 治療后的反應(yīng)性及預(yù)后的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文為回顧性研究，研究FoxM1 的表達(dá)水平對(duì)以順鉑為主的TACE 介入化療效果的影響，發(fā)現(xiàn)FoxM1 高表達(dá)與肝內(nèi)腫瘤的數(shù)目密切相關(guān)，患者5年DFS 與肝內(nèi)腫瘤數(shù)目、FoxM1 高表達(dá)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)oxM1 高表達(dá)者經(jīng)TACE 介入化療后DFS明顯少于低表達(dá)者。說(shuō)明FoxM1 高表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移及耐藥株的形成有著一定的相關(guān)性，具體是通過(guò)什么通路發(fā)揮作用，還需進(jìn)一步的研究。在惡性間皮瘤中FoxM1 和Hippo 信號(hào)通路之間具有相關(guān)性，抑制Hippo 信號(hào)通路，能導(dǎo)致FoxM1 過(guò)表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的形成[13]。此外，F(xiàn)oxM1 和Hippo-Yes 相關(guān)蛋白(yesassociated protein,YAP)表達(dá)呈正相關(guān)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因小鼠和肝癌組織的分析發(fā)現(xiàn)，YAP 與FoxM1 協(xié)同作用導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，而阻斷這一途徑的藥物可能被開(kāi)發(fā)成肝癌的治療方法[14]。FoxM1的作用模式是通過(guò)激活細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)節(jié)因子、抗氧化基因和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化表型、侵襲和轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞逃避生長(zhǎng)抑制物[15]。

綜上所述，F(xiàn)oxM1 是一種重要的增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞周期中廣泛表達(dá)，與細(xì)胞增殖、自我更新和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)FoxM1 在HCC癌組織中高表達(dá)，與肝內(nèi)腫瘤數(shù)目密切相關(guān)，F(xiàn)oxM1可作為評(píng)估HCC 患者行TACE 預(yù)后療效的獨(dú)立分子指標(biāo)，用于判斷患者TACE 治療效果，是一個(gè)新的判斷HCC 患者術(shù)后輔助性介入治療效果的預(yù)后因子。該研究為FoxM1 作為HCC 治療靶基因提供重要依據(jù)。