劉 蘇，陸 純，黃 歡，孫 麗，王司曄

(1 南通大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，南通 226001；2 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是影響人類健康的常見疾病之一，其發(fā)生率和死亡率均較高[1-2]。重度顱腦損傷患者治療效果差，致死率和致殘率均較高，幸存患者生活質(zhì)量差[3]。TBI 后繼發(fā)性損傷中，神經(jīng)炎癥反應(yīng)一直備受關(guān)注，其引發(fā)持續(xù)炎性免疫反應(yīng)，損害腦功能[4-5]。神經(jīng)免疫反應(yīng)初期分泌大量的促炎和抗炎因子，募集外周免疫細(xì)胞和激活腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，在此過程中趨化因子是將外周血細(xì)胞募集到受損組織的主要介質(zhì)之一，在神經(jīng)免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本課題組在前期動(dòng)物研究[6]中發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致TBI 大鼠損傷區(qū)皮層中趨化因子配體2(chemokine C-C motif ligand 2,CCL2)表達(dá)增加，抑制其表達(dá)可減緩神經(jīng)功能受損和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。臨床研究[7-8]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL2、趨化因子CXC 配體[chemokine(C-X-C motif) ligand,CXCL]1 在重度顱腦損傷患者的神經(jīng)炎癥中發(fā)揮著重要作用。本研究觀察重度TBI 患者外周血中趨化因子CCL5、CXCL10、CXCL13 的表達(dá)變化，分析這些趨化因子對(duì)TBI 患者損傷程度和預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 TBI 組血液標(biāo)本取自2016 年10月—2017 年12 月期間在南通大學(xué)附屬醫(yī)院因重度TBI 住院患者39 例，采集時(shí)間點(diǎn)分別為術(shù)后1 d、3 d和7 d。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有明確的顱腦外傷史，如交通事故、高空墜落等，經(jīng)過CT 等影像學(xué)檢查明確診斷，并于傷后24 h 內(nèi)住院；(2)入院時(shí)格拉斯哥昏迷評(píng)分(Glasgow coma scale,GCS)為3～8 分；(3)達(dá)到開顱手術(shù)指征，且為入院24 h 內(nèi)行開顱手術(shù)；(4)年齡20～70 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有腦功能損害病史；合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎等重要臟器損傷。對(duì)照組血液標(biāo)本取自同期在南通大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心的健康體檢者，共13 名。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本研究經(jīng)南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料的比較(,n,%)

表1 兩組一般資料的比較(,n,%)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外周血清CCL5、CXCL10、CXCL13 檢測 TBI組患者于術(shù)后1、3 和7 d 抽取靜脈血2 mL，對(duì)照組于清晨空腹采集外周靜脈血2 mL。血液標(biāo)本采集完畢后室溫靜置20 min，3 000 r/min 離心15 min 后分離上層血清，隨后置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物試劑公司。使用Bio-Tek 全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測吸光度(optical density,OD)值并計(jì)算各樣本中CCL5、CXCL10、CXCL13 的濃度。蛋白質(zhì)濃度通過BCA 蛋白測定法(Pierce，Rockford，IL，美國)進(jìn)行測定。對(duì)于96 孔板中的每個(gè)反應(yīng)，均取100 μg 總蛋白，ELISA 檢測方法根據(jù)說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 GCS 和格拉斯哥結(jié)局量表評(píng)分(Glasgow outcome scale,GOS) TBI 患者入院后、術(shù)后30 d 運(yùn)用GCS 評(píng)分評(píng)估患者的意識(shí)障礙程度。GCS 由睜眼反應(yīng)、語言反應(yīng)和肢體運(yùn)動(dòng)3 個(gè)方面組成，最高15 分，為意識(shí)清楚；12～14 分為輕度意識(shí)障礙；9～11 分為中度意識(shí)障礙；≤8 分為昏迷；分?jǐn)?shù)越低則表示意識(shí)障礙越嚴(yán)重。術(shù)后30 d 采用GOS 評(píng)分評(píng)估判斷患者預(yù)后情況。GOS 評(píng)分：1 分，死亡；2 分，持續(xù)性植物狀態(tài)；3 分，重度殘疾；4 分，中度殘疾；5 分，恢復(fù)良好。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以表示，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重度TBI 組的不同時(shí)間點(diǎn)外周血清中CCL5、CXCL10、CXCL13 表達(dá)含量分別和對(duì)照組相比采用Dunnett檢驗(yàn)；重度TBI 患者不同時(shí)間點(diǎn)外周血清中CCL5、CXCL10、CXCL13 表達(dá)含量與入院當(dāng)天GCS 評(píng)分、術(shù)后30 d GCS 評(píng)分和GOS 評(píng)分間的相關(guān)性分析采用Spearman 法。

2 結(jié) 果

2.1 兩組外周血液中CCL5、CXCL10、CXCL13 的表達(dá) TBI 組患者3 種趨化因子在術(shù)后1 d 表達(dá)均最高，隨后表達(dá)逐漸下降，但表達(dá)量仍保持較高水平。與對(duì)照組相比，TBI 組患者外周血液中CCL5、CXCL10、CXCL13 的表達(dá)量均明顯升高。表明CCL5、CXCL10、CXCL13 這3 種趨化因子在重度TBI 患者中表達(dá)增高，且在疾病早期表達(dá)即達(dá)高峰，隨后逐漸下降(表2)。

表2 兩組外周血液中CCL5、CXCL10、CXCL13 的表達(dá)(,pg/mL)

表2 兩組外周血液中CCL5、CXCL10、CXCL13 的表達(dá)(,pg/mL)

2.2 重度TBI 患者外周血液中CCL5、CXCL10、CXCL13 的表達(dá)量與GCS、GOS 評(píng)分的相關(guān)性分析 結(jié)果表明，重度TBI 患者術(shù)后1 d 血液中CCL5 的蛋白濃度與入院GCS 評(píng)分、術(shù)后30 d GOS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05,P<0.01)。術(shù)后1 d 血液中CXCL10 濃度與GOS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，術(shù)后3 d CXCL10 的濃度與術(shù)后30 d GCS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與GOS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。術(shù)后1 d 血液中CXCL13 表達(dá)量與入院GCS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，術(shù)后7 d 與GOS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(表3)。

表3 TBI 患者血液CCL5、CXCL10、CXCL13 與GCS、GOS 評(píng)分的相關(guān)分析

3 討 論

趨化因子是細(xì)胞因子家族中的一個(gè)大亞群，可將多種免疫細(xì)胞吸引到損傷部位。研究[9-12]表明與TBI 有關(guān)的趨化因子有很多，包括CCL2、CCL20、CXCL1、CXCL8、CXCL10、CXCL11、CXCL12 等。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，CCL5 及其受體具有多種功能，包括促進(jìn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)和針對(duì)各種神經(jīng)毒素的神經(jīng)保護(hù)作用等。CCL5 主要定位于腦內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。A.DéNES等[13]發(fā)現(xiàn)，慢性感染可通過CCL5 介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)并加劇腦損傷的發(fā)生，說明CCL5 可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并延遲炎癥消退，加重顱內(nèi)損傷。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，在星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元中可以發(fā)現(xiàn)CCL5 及其受體CCR5 表達(dá)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)重度TBI 患者外周血液內(nèi)CCL5 在損傷早期表達(dá)迅速升高，術(shù)后1 d 最高，隨后逐漸下降，但術(shù)后7 d 仍明顯高于對(duì)照組，說明CCL5 在腦損傷后持續(xù)存在，參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)。CXCL10 可被單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞所吸引，具有促進(jìn)T 細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞、抗腫瘤活性以及抑制骨髓集落形成和血管生成等作用。腦損傷后CXCL10 在神經(jīng)元中表達(dá)，通過激活的小膠質(zhì)細(xì)胞將其募集至損傷部位。在小鼠TBI 模型中發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)和皮質(zhì)下區(qū)域中CXCL10 的細(xì)胞簇迅速出現(xiàn)[14]。CXCL10 以劑量依賴性方式誘導(dǎo)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，表明CXCL10 水平升高在血管病變和腦損傷過程中產(chǎn)生作用，通過降低CXCL10 的水平可促進(jìn)血管生成、減少凋亡細(xì)胞數(shù)量和增加血管內(nèi)皮生成因子的生成[15]。本研究通過測定重度TBI 患者外周血液中趨化因子CXCL10 的蛋白量發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，CXCL10 表達(dá)明顯增高，早期表達(dá)高且下降緩慢，至術(shù)后7 d 表達(dá)量仍處于較高水平。通過細(xì)胞學(xué)水平研究[16]發(fā)現(xiàn)，給予原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎性刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速分泌CXCL13，且表達(dá)量較高。本研究中重度TBI 患者外周血清中趨化因子CXCL13 主要在TBI 早期表達(dá)較高，隨后下降，可能更多地參與腦損傷的早期病理過程。

CXCL12 及其受體CXCR4 參與包括TBI 等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展。與對(duì)照組或TBI 后30 d 仍存活的患者相比，死亡患者的血液中CXCL12 濃度顯著增加，且血液CXCL12 濃度與損傷后的嚴(yán)重程度及30 d 死亡率密切相關(guān)，可作為30 d 死亡率的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測因子，表明CXCL12 可能成為TBI 的新型預(yù)后生物標(biāo)志物[17]。新近研究[18]進(jìn)一步證實(shí)血液CXCL12 可作為顱腦損傷患者預(yù)后的有效生物標(biāo)志物。大鼠血液CCL2(即MCP-1)表達(dá)量與顱腦損傷程度呈正相關(guān)，可作為評(píng)判大鼠TBI 程度的觀察指標(biāo)[19]。我們前期臨床研究[7-8]也發(fā)現(xiàn)在重度TBI 患者的受損腦組織的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)有CXCL1 和CCL2 的表達(dá)，且特重型TBI 患者腦損傷程度與外周血中CXCL1 和CCL2 濃度呈負(fù)相關(guān)，即CXCL1、CCL2 表達(dá)量越高，腦損傷越重，預(yù)后越差。通過Spearman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，重度TBI 患者術(shù)后1 d 血液中CCL5 的蛋白濃度與入院GCS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，術(shù)后3 d CXCL10 的濃度與術(shù)后30 d GCS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，術(shù)后1 d CXCL13 表達(dá)量與入院GCS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，提示外周血液中CCL5、CXCL10、CXCL13 的表達(dá)量與損傷程度具有相關(guān)性，即表達(dá)量越高，腦損傷程度越嚴(yán)重。同時(shí)，重度TBI 患者術(shù)后1 d CCL5 的濃度與術(shù)后30 d GOS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，術(shù)后1 d 和3 d 的血液中CXCL10 濃度與GOS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，術(shù)后7 d CXCL13 濃度與GOS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)提示CCL5、CXCL10 和CXCL13 與患者的預(yù)后相關(guān)，即表達(dá)量越高，預(yù)后可能越差。

綜上所述，CCL5、CXCL10、CXCL13 在TBI 早期的神經(jīng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在腦損傷后其表達(dá)量迅速增加，在一定程度上與腦損傷的嚴(yán)重程度相關(guān)，且其表達(dá)量與患者的預(yù)后有一定的相關(guān)性。