胡亞娥，楊 萍，茅家慧，楊 勇

(1 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，南通 226001；2 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科)

肺癌是嚴(yán)重威脅人類生存的主要惡性腫瘤之一。全球范圍內(nèi)肺癌發(fā)病率與死亡率在男性人群中均處于各種惡性腫瘤的首位；女性人群中，肺癌的發(fā)病率位居第四，而死亡率高居第二[1-2]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌病例的85%，NSCLC 主要包括腺癌和鱗狀細(xì)胞癌兩種組織學(xué)類型[3]。盡管有手術(shù)、化學(xué)療法和靶向療法等治療手段，但NSCLC 患者的5 年生存率僅為15%[4]。NSCLC 的高死亡率部分原因是腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，另一部分原因是缺乏有效的早期檢測(cè)及評(píng)估預(yù)后的手段。因此，鑒定新的腫瘤生物標(biāo)志物在NSCLC 的臨床診斷、病情評(píng)估及預(yù)后評(píng)估過程中顯得尤為重要。

高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)是一種非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白，在真核細(xì)胞中廣泛存在，其蛋白結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)同源的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(A 和B 盒)和一個(gè)C 末端。細(xì)胞核內(nèi)的HMGB1 可參與基因轉(zhuǎn)錄、DNA 復(fù)制和基因表達(dá)調(diào)節(jié)，而釋放到細(xì)胞外的HMGB1 在炎癥和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[5]。研究[6-7]表明，HMGB1 在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系非常密切。近年來關(guān)于HMGB1在NSCLC 中表達(dá)的研究仍存在爭(zhēng)議。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)HMGB1 在NSCLC 組織中表達(dá)上調(diào)，在NSCLC 的診斷和預(yù)后判斷中起重要作用。但X.K.SHEN 等[10]發(fā)現(xiàn)HMGB1 在NSCLC 組織中表達(dá)下調(diào)。因此，本研究檢測(cè)NSCLC 患者肺癌和癌旁組織中HMGB1 mRNA和蛋白的表達(dá)及NSCLC 患者血漿HMGB1 水平，并分析患者血漿HMGB1 水平與NSCLC 臨床特征的關(guān)系，進(jìn)一步明確血漿HMGB1 水平檢測(cè)在NSCLC診療過程中的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 病例來源 本研究選取南通大學(xué)附屬醫(yī)院和蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院2015 年10 月—2017 年10月收治的NSCLC 患者50 例，年齡45～83 歲，平均64 歲，所有患者經(jīng)病理檢查確診為NSCLC，未接受過化療。正常對(duì)照組為正常體檢人群30 例，年齡42～79 歲，平均62 歲。該研究得到南通大學(xué)附屬醫(yī)院和蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 組織和血漿標(biāo)本收集 收集NSCLC 患者術(shù)后肺癌腫瘤組織和癌旁組織(距離癌組織邊緣5 cm，且病理證實(shí)為正常肺組織)，-80 ℃保存。研究對(duì)象空腹12 h，早晨采集肘靜脈血3 mL，置于3.2%枸櫞酸鈉抗凝管內(nèi)(抗凝劑∶全血=1∶9)，混勻后4 ℃，2 500 g 離心10 min。保留血漿，-80 ℃保存。

1.3 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測(cè)HMGB1 mRNA 水平 TrizolTM試劑提取肺癌組織和癌旁組織的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas,CA)說明書操作。將2 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。HMGB1引物上游：5′-TCAAAGGAGAACATCCTGGCCTGT-3′；下游：5′-CTGCTTGTCATCTGCAGCAGTGTT-3′。GAPDH 引物上游：5′-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′；下游：5′-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3′。SYBR Green 混合液(ABI,USA) 5 μL、cDNA 0.5 μL、上游及下游引物各0.2 μL 和4.1 μL 不含核酸酶的水組成總體積10 μL 的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：95 ℃10 min 1 次循環(huán)初始變性，95 ℃15 s 變性，循環(huán)40 次，60 ℃30 s 退火，72 ℃30 s 延伸。GAPDH作為內(nèi)參，2-△△CT方法計(jì)算基因表達(dá)水平。HMGB1/GAPDH 比值表示HMGB1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western Blot 檢測(cè)HMGB1 蛋白水平 肺癌組織和癌旁組織在裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑)中4 ℃裂解30 min，12 000 g 離心10 min。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離10 μg 總蛋白，在恒電流(200 mA)下，轉(zhuǎn)膜120 min。PVDF 膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，兔抗人HMGB1 單克隆抗體(1∶10 000;Abcam,USA)，4 ℃搖床過夜，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶10 000;Bioworld,USA)，室溫?fù)u床孵育1 h。采用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。GAPDH 作為內(nèi)參，ImageJ 圖像軟件分析，HMGB1/GAPDH 比值表示HMGB1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血漿HMGB1 水平 按照人HMGB1 ELISA 試劑盒(Shino-Test,Japan)說明書操作。酶標(biāo)板的每個(gè)孔中先加入100 μL 樣品稀釋液，再加入標(biāo)準(zhǔn)品和血漿樣品10 μL，37 ℃水浴24 h。洗滌后每孔加入100 μL 過氧化物酶標(biāo)記的抗HMGB1，2 單克隆抗體溶液，室溫2 h。洗滌后每孔加入100 μL 底物溶液(50 μL A 液+50 μL B 液)，室溫避光孵育30 min。加入100 μL 終止液，多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD450值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HMGB1 在NSCLC 組織中的表達(dá)增加 RTqPCR 結(jié)果顯示，NSCLC 組織中HMGB1 mRNA 的表達(dá)水平是癌旁組織的2.98 倍(圖1A)。Western Blot結(jié)果顯示，NSCLC 組織中HMGB1 蛋白表達(dá)水平是癌旁組織的1.83 倍(圖1B～C)。

圖1 癌旁肺組織和肺癌組織中HMGB1 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平

2.2 NSCLC 患者血漿HMGB1 水平升高，術(shù)后下降ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示正常對(duì)照組血漿HMGB1 水平為(2.27±0.63)ng/mL，NSCLC 患者為(5.86±1.60)ng/mL。與正常對(duì)照組比較，NSCLC 患者血漿HMGB1 水平顯著升高(P<0.01)(圖2A)。

NSCLC 患者血漿HMGB1 水平在術(shù)前為(5.67±0.67) ng/mL，術(shù)后為(3.34±0.67) ng/mL。與術(shù)前比較，NSCLC 患者術(shù)后血漿HMGB1 水平顯著降低(P<0.01)(圖2B)。

圖2 NSCLC 患者血漿HMGB1 水平

2.3 血漿HMGB1 水平與NSCLC 臨床特征的關(guān)系NSCLC 患者按照年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、臨床分期及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)一步分組，結(jié)果表明，腫瘤直徑≥3 cm 的NSCLC 患者血漿HMGB1 水平明顯高于腫瘤直徑＜3 cm 者(P＜0.01)。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期的NSCLC 患者血漿HMGB1 水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期的患者(P＜0.01)。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者血漿HMGB1 水平較無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者明顯升高(P＜0.01)。而按照年齡、性別及病理類型分組比較，年齡＜60 歲與≥60 歲，男與女，腺癌組與鱗癌組的患者血漿HMGB1 水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)(表1)，提示NSCLC 患者血漿HMGB1 水平與腫瘤大小、臨床分期及有無(wú)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但與患者年齡、性別及病理類型無(wú)明顯相關(guān)性。

表1 血漿HMGB1 水平與NSCLC 患者臨床特征的關(guān)系ng/mL

3 討 論

細(xì)胞外HMGB1 作為一種細(xì)胞因子參與炎癥和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，HMGB1 在乳腺癌[11]、胃癌[12]、肝細(xì)胞癌[13]等多種類型的惡性腫瘤中表達(dá)增加并促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。由于檢測(cè)方法、樣本量大小及統(tǒng)計(jì)方法的不同，關(guān)于HMGB1 在NSCLC 中的表達(dá)是否升高的結(jié)論不一致。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC 癌組織表達(dá)的HMGB1 mRNA 和蛋白水平均較癌旁組織明顯升高，這與以往采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)NSCLC腫瘤組織中HMGB1 蛋白表達(dá)的結(jié)果[8,14]一致。

HMGB1 釋放到細(xì)胞外有兩種可能的機(jī)制：由激活的免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌或從受損或壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外[7]。在化療過程中，壞死的腫瘤細(xì)胞核內(nèi)HMGB1 被動(dòng)釋放增加。腫瘤細(xì)胞也可在受到內(nèi)源性或外源性刺激因素作用下主動(dòng)分泌HMGB1[15]。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者血漿HMGB1 水平與正常對(duì)照組比較明顯升高，此外患者腫瘤切除術(shù)后血漿HMGB1 水平較術(shù)前明顯降低。這些結(jié)果說明NSCLC 患者血漿HMGB1 的升高可能機(jī)制是腫瘤細(xì)胞表達(dá)和釋放HMGB1 增加，或肺癌組織中心區(qū)域凋亡或壞死細(xì)胞分泌HMGB1 增加。當(dāng)腫瘤細(xì)胞分泌HMGB1 時(shí)，會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、血管新生和轉(zhuǎn)移[16-17]。NSCLC 患者血漿HMGB1水平升高可以促進(jìn)病情惡化。檢測(cè)患者血漿HMGB1水平可作為肺癌篩選和反映病情的指標(biāo)之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC 患者血漿HMGB1 水平與腫瘤大小、臨床分期及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。隨著腫瘤直徑的增大、臨床分期的增加及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，患者血漿HMGB1 水平明顯升高。對(duì)于肺癌術(shù)后患者，血漿HMGB1 的水平明顯下降，結(jié)果提示血漿HMGB1 的水平可間接反映肺癌患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷，同時(shí)可作為病情評(píng)估和臨床療效評(píng)估的重要指標(biāo)。而對(duì)NSCLC 患者不同病理類型血漿HMGB1 水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，腺癌患者和鱗癌患者之間無(wú)明顯差異，提示血漿HMBG1 水平與NSCLC 病理類型之間并無(wú)明顯相關(guān)性，可能是因?yàn)獒尫臜MGB1 的細(xì)胞類型并無(wú)選擇性。本實(shí)驗(yàn)中患者血漿HMGB1 水平與NSCLC 臨床特征之間的關(guān)系與已發(fā)現(xiàn)的肺癌組織中HMGB1 的表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系[8]類似。

總之，NSCLC 癌組織中HMGB1 表達(dá)高于癌旁組織，NSCLC 患者血漿HMGB1 的水平高于健康人群，術(shù)后明顯下降，且患者血漿HMGB1 水平與腫瘤大小、臨床分期及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，血漿HMGB1 作為一類新型腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物，在NSCLC 的診斷、病情和療效的評(píng)估中有應(yīng)用前景。