蔣 銳，沈劍虹，陳一楠，林 毅，倪蘭春，施 煒*

(南通大學附屬醫(yī)院神經外科，南通 226001)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是臨床上最常見的中樞神經系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷，目前研究[1-2]認為TBI 后的繼發(fā)性腦損傷是以神經細胞丟失、凋亡為主要特征的病變，同時CNS 中神經元損傷后自身無法獲得再生。盡管近年來細胞移植治療成為TBI 后神經修復治療的熱點[3]，但由于CNS 中自身內源性神經干細胞(endogenous neural stem cells,eNSCs)數量有限，造成了內源性神經修復途徑受到限制。所以，通過外源性種子細胞移植來獲得神經修復成為目前TBI 后細胞替代治療的主要研究方向。對于外源性種子細胞的選擇，雖然神經干細胞(neural stem cells,NSCs)作為外源性干細胞最早被用于細胞移植，然而NSCs 實際操作中獲取十分困難，不利于使用；近年來，誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)成為神經修復中的熱門種子細胞并被寄予厚望[4]。由于iPSCs 本身具有多潛能分化能力及復制能力等特點；更為重要的是，相較于NSCs、胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)等其他類型的干細胞，iPSCs 可以利用患者自己的體細胞來制備其專有的誘導多能干細胞，因而不會產生免疫排斥[5]；此外，iPSCs 還具有來源廣泛、相對容易獲得的優(yōu)點。因此，iPSCs 作為組織工程中極為重要的一種外源性種子細胞得到了極大的推廣。在各種原因引起腦損傷時，星形膠質細胞對神經細胞的保護作用包括調節(jié)胞外環(huán)境、產生及釋放生長因子、調節(jié)免疫反應、提供神經遞質前體物質及三羧酸循環(huán)中間產物、攝取神經遞質支持神經元、參與突觸神經元的生成。此外，星形膠質細胞中的線粒體是細胞能量代謝及氨基酸類神經遞質(谷氨酸、γ-氨基丁酸等)物質前體合成的主要場所，與神經元的存活有關[6-7]。因此，本研究將星形膠質細胞與iPSCs 進行共培養(yǎng)，體外研究其對于iPSCs 的作用及機制，以期將星形膠質細胞與iPSCs 共同進行移植，為移植細胞的存活及神經元的生長及發(fā)育提供更有利的環(huán)境。

本研究首先驗證炎癥激活的星形膠質細胞對于iPSCs 增殖的作用；然后，將炎癥激活的星形膠質細胞與iPSCs 共同進行體內移植，在一定的時間后切片觀察體內iPSCs 的存活情況；最后，對產生上述現象的機制進行初步研究，通過轉錄組測序等方法初步明確激活的星形膠質細胞產生促進iPSCs 增殖作用的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 新生1 d 的SD 大鼠，雌雄不限，由南通大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 體外大鼠星形膠質細胞原代培養(yǎng)及鑒定 取新生1 d 的SD 大鼠，75%乙醇消毒后在超凈臺下剪開頭部皮膚及顱骨，取出完整腦組織，分離出雙側大腦皮質并置于有DMEM/F12 的細胞培養(yǎng)皿內，將大腦皮質剪至1 mm3大小的組織塊，將組織機械吹打至無明顯組織塊，靜置10 min 后，取上層懸液以1 000 r/min 的速度離心5 min，重復3 次；用含10%胎牛血清的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基重懸細胞，以不銹鋼濾網(Φ=200 μm)過濾，用細胞計數板進行細胞計數；以24 孔板每孔5×104個細胞接種至多聚賴氨酸包被后的孔內，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。后用膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體進行熒光染色驗證。本實驗方案獲南通大學實驗動物倫理委員會批準(S20200315-002)。

1.2.2 重編程星形膠質細胞為iPSCs 并鑒定 大鼠iPSCs 細胞誘導生成慢病毒試劑盒購于上海斯丹賽生物有限公司，根據試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 Western Blot 用50 μL 2×樣品緩沖液重懸細胞，置于開水煮沸10 min。待樣品冷卻至室溫后，12 000 g 離心2 min，取20 μL 上清進行十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳，待電泳完成后，將蛋白樣品轉印至PVDF 膜上，使用相應抗體作為一抗，檢測相應蛋白的表達情況。標記β-actin 抗體作為對照。

1.2.4 免疫熒光 實驗前準備好明膠預包被的小圓片并放入24 孔板中，加入iPSCs 細胞培養(yǎng)液并置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第2 天，將iPSCs 消化后重懸，根據細胞密度按比例加入已準備好的24 孔板中，待克隆重新形成，大小適中時吸去培養(yǎng)液，0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗3遍，加入適量4%多聚甲醛，室溫固定30 min，吸去多聚甲醛，用0.01 mol/L PBS 洗3 遍，添加封閉液，室溫封閉2 h，再用0.01 mol/L PBS 洗3 遍，添加一抗鼠抗SSEA1 單克隆抗體(1∶500 稀釋)，放入4 ℃冰箱孵育過夜，0.01 mol/L PBS 洗3 遍，加入羊抗鼠二抗(1∶1 000 稀釋)、Hoechst33342(1∶2 000 稀釋)，避光下孵育20 min，0.01 mol/L PBS 洗3 遍后，甘油緩沖液封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 細胞增殖檢測 將星形膠質細胞接種至24孔板專用Transwell 小室內，添加培養(yǎng)液至1 mL/孔，并按5 μg/mL 加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，將iPSCs 接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h 后，將載有星形膠質細胞的Transwell 小室轉移至24 孔板內，并添加iPSCs 細胞完全培養(yǎng)基至1.5 mL，分別于24、48、72、96 h 取出Transwell 小室，加入500 μL 含10%細胞計數試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)溶液的DMEM/高糖基礎培養(yǎng)基孵育2 h；用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度值(optical density,OD)。

1.3 統(tǒng)計學方法 數據分析采用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件，數據均以表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 LPS激活的星形膠質細胞促進iPSCs 的增殖首先采用不同濃度LPS 刺激星形膠質細胞，通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)驗證刺激后釋放出的白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎癥因子的表達水平，結果顯示5 μg/mL LPS 刺激下星形膠質細胞活化程度最高(圖1A)。使用大鼠iPSCs 生成試劑盒感染大鼠星形膠質細胞后，干細胞基因Sox2、Oct4、Nanog 和Rex1 的表達增加(圖1B～C)。接著，在體外共培養(yǎng)經LPS 激活的星形膠質細胞和iPSCs。將iPSCs 與活化的星形膠質細胞按不同濃度、不同時間共培養(yǎng)，CCK-8 法結果顯示，當炎癥激活的星形膠質細胞按5∶1 的比例與iPSCs 細胞共培養(yǎng)72 h 時，其OD450值較不同時間點組差異更為明顯(圖1D)。這表明可通過與星形膠質細胞共培養(yǎng)來促進iPSCs 的增殖活性。進一步通過流式細胞術證實了這一結果，當iPSCs 與活化的星形膠質細胞共培養(yǎng)時，處于S期的細胞更多(圖1E)。免疫熒光也確認了這些結果(圖1F)。共培養(yǎng)組的Ki-67 陽性iPSCs 比對照組多。結果表明，LPS 活化的星形膠質細胞可以促進iPSCs 增殖。

圖1 LPS 激活的星形膠質細胞促進iPSCs 的增殖

2.2 轉錄組測序 盡管已經證明活化的星形膠質細胞會促進iPSCs 增殖，但是具體機制仍然未知。因此，對iPSCs 進行了轉錄組分析。使用京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析檢查了原始星形膠質細胞和活化的星形膠質細胞，發(fā)現LPS 刺激后胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1,IGF-1)的表達顯著增加(圖2A)。還發(fā)現，IGF-1 與癌癥通路以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路相關(圖2B)。通過對共培養(yǎng)的iPSCs 進行KEGG分析，發(fā)現PDZ 結合激酶(PDZ-binding-kinase,PBK)和細胞周期相關的途徑高度豐富，包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)途徑(圖2C～D)。

圖2 轉錄組測序

2.3 LPS 激活的星形膠質細胞通過IGF-1 分泌促進iPSCs 存活和增殖 在活化的星形膠質細胞中，IGF-1 的表達明顯上調(圖3A～C)。IGF-1 的釋放與細胞密度有關。當細胞密度≥104個細胞時，檢測到IGF-1 的表達水平達到高峰(圖3D)。此外，使用不同濃度的LPS 刺激星形膠質細胞，發(fā)現LPS 達到10 μg/mL 時，IGF-1 的表達水平最高(圖3E)。為了進一步證明星形膠質細胞分泌的IGF-1 在iPSCs 增殖中的作用，在星形膠質細胞中過表達IGF-1，結果表明iPSCs 與過表達IGF-1 的星形膠質細胞共培養(yǎng)時發(fā)生增殖，并且共培養(yǎng)的iPSCs 的生存能力得到了提高(圖3F)，而且，免疫熒光分析也證明了iPSCs 細胞膜上存在IGF-1 受體的表達(圖3G)。

2.4 上調PBK 通過直接與PI3K 結合來激活PI3K/AKT 信號通路 為進一步闡明活化的星形膠質細胞分泌的IGF-1 促進iPSCs 增殖的機制，對共培養(yǎng)的iPSCs 進行了轉錄組學分析。通過差異基因表達的分析，發(fā)現與活化的星形膠質細胞共培養(yǎng)的iPSCs 中PBK 的表達顯著上調，而p-PI3K、p-AKT 的趨勢與之相仿(圖4A～C)。免疫熒光檢測結果也顯示PI3K、AKT、p-PI3K 和p-AKT 在與活化的星形膠質細胞共培養(yǎng)的iPSCs 中高表達(圖4D)。為了進一步研究PBK 對PI3K/AKT 途徑的影響，使用病毒干擾iPSCs中的PBK，并檢測了下游分子p-AKT 和p-PI3K。結果顯示，當PBK 的表達降低時，AKT 和PI3K 的表達沒有改變，而p-AKT 和p-PI3K 的表達則明顯降低(圖4E)。

圖4 PBK 通過直接與PI3K 結合來激活PI3K/AKT 信號通路

隨后，使用免疫熒光和蛋白質印跡進一步檢測了PI3K/AKT 通路下游蛋白的表達。結果表明，XIAP、P27KIP、mTOR 和p-mTOR 這些下游分子在與活化的星形膠質細胞共培養(yǎng)的iPSCs 中均顯著上調(圖5A～C)。

圖5 PI3K/AKT 通路起的下游蛋白表達檢測

3 討 論

TBI 分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷[8-9]。外部機械力的損傷作用是原發(fā)性腦損傷最主要的發(fā)病機制，而炎癥反應則是繼發(fā)性腦損傷的重要發(fā)病機制[10]。TBI 后的腦實質內有大量的細胞因子及趨化因子表達量發(fā)生變化，這些因子的變化使炎癥水平級聯式升高，從而導致氧自由基過載、線粒體功能紊亂、興奮性氨基酸釋放過多等，造成大量細胞凋亡及神經功能缺失[11]。

細胞移植治療TBI 后所造成的神經功能障礙成為目前研究的熱點。近年來，NSCs、間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、ESCs 及iPSCs 等作為種子細胞在多種神經系統(tǒng)疾病中的作用被廣泛研究[12-15]。目前，iPSCs 移植治療的方法已經在諸如帕金森病、阿爾茨海默病、側索硬化等神經系統(tǒng)疾病研究中獲得了理想的結果[16-19]。因此，在本研究選擇iPSCs 作為種子細胞。

但值得一提的是，盡管細胞移植治療技術已經獲得較大突破，但iPSCs 移植與其他細胞移植一樣，都存在細胞移植效率低的難題，從而導致了缺乏足夠量存活的種子細胞來補充丟失的神經細胞。最近，有研究[20]表明，相對于傳統(tǒng)的單細胞移植，腦損傷后通過干細胞聯合其他輔助細胞的“雙細胞”移植更有利于移植的種子細胞在大腦中存活、增殖。星形膠質細胞是CNS 中含量最為豐富的膠質細胞。最新的研究[20]結果發(fā)現，體外LPS 誘導炎癥活化的星形膠質細胞與MSCs 共培養(yǎng)，可以促進MSCs 的增殖，并且在TBI 后將受LPS 炎癥激活的星形膠質細胞與MSCs 雙細胞聯合移植有利于MSCs 在體內的存活及增殖。因此，在本研究中，將LPS 誘導的活化星形膠質細胞與iPSCs 在體外共培養(yǎng)，以期發(fā)現炎癥激活的星形膠質細胞能否促進iPSCs 增殖，從而有利于iPSCs 移植后存活。本研究首次發(fā)現活化的星形膠質細胞在體外能夠促進iPSCs 的增殖；這提示雙細胞共同移植具有良好的應用價值。

進一步實驗闡明了活化的星形膠質細胞可導致IGF-1 生長因子表達上調，由活化的星形膠質細胞分泌的IGF-1 等可能通過作用于iPSCs 表面相應的IGF-1R，從而與PBK 發(fā)生反應，導致PI3K/AKT 信號通路磷酸化增強，進而促進了iPSCs 的增殖。為以后選擇合適靶點促進iPSCs 增值提供了相應的理論基礎。

當然，闡明IGF-1 作用于iPSCs 促進其增殖的內在機制仍有許多問題值得深入研究，如：活化的星形膠質細胞中IGF-1 上調的原因是什么？PBK 與PI3K是如何產生相互作用的？這些問題還需要進一步明確。

總之，本研究為星形膠質細胞重編程而來的iPSCs 作為TBI 后干細胞移植的種子細胞奠定了實驗基礎，同時為TBI 后通過活化的星形膠質細胞與iPSCs 聯合移植促進iPSCs 的存活提供了思路，為開展雙細胞聯合移植進行CNS 神經再生修復提供了理論依據。