王 艷

(洛陽東方醫(yī)院/河南科技大學第三附屬醫(yī)院檢驗科，河南 洛陽 471003)

血流感染是一種嚴重的全身感染性疾病，病原微生物在血液循環(huán)中呈一過性、間歇性或持續(xù)性存在，包括膿毒血癥、膿毒癥、菌血癥，其可對機體所有臟器造成損害，嚴重者可導致休克、多臟器衰竭、彌散性血管內(nèi)凝血甚至死亡。兒童尤其是嬰幼兒黏膜和生物屏障未完全建立，對病原菌包括低毒力的條件致病菌易感[1]；此外，濫用廣譜抗菌藥物、長期使用腎上腺皮質(zhì)激素、器官移植和侵入性新診療技術的推廣應用都是誘發(fā)兒童血流感染的主要原因，血流感染已成為兒童嚴重感染性疾病，其病死率高達12.0%～20.5%[2]。金黃色葡萄球菌是兒童感染最常見的一種病原菌，引起兒童多種感染性疾病，如皮膚膿皰瘡、傷口感染、骨髓炎、細菌性心內(nèi)膜炎和新生兒膿毒血癥等；金黃色葡萄球菌尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphyloco-ccusaureus，MRSA)血流感染率明顯升高，患者感染MRSA后治療過程困難，預后較差，病死率高[3]。因此，及時、準確地檢測兒童血流感染的病原菌并選擇合適的抗菌藥物是臨床治療的關鍵。本研究旨在探討兒童血流感染的病原菌分布、耐藥性，以期為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年1月至2019年12月洛陽東方醫(yī)院(河南科技大學第三附屬醫(yī)院)兒科病房收治的70例血流感染患兒為研究對象。病例納入標準：(1)年齡≤14歲；(2)血培養(yǎng)陽性；(3)符合《醫(yī)院感染診斷標準(試行)》[4]血流感染診斷標準。病例排除標準：(1)血培養(yǎng)結果判定為污染；(2)近期使用過抗生素。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患兒監(jiān)護人均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血標本分離培養(yǎng)患兒在使用抗生素前從左右肘正中靜脈或貴要靜脈采集雙套靜脈血各1～3 mL 注入血培養(yǎng)瓶(購自山東鑫科生物公司)，同1例患者不同部位所分離出的同1菌株只入選第1株。血培養(yǎng)瓶有細菌生長后，將陽性培養(yǎng)物接種于血平板，35 ℃恒溫箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，挑取血平板上菌落。

1.2.2 病原菌鑒定及藥物敏感性試驗采用美國貝克曼公司MicroScan Walkaway 96 plus全自動細菌鑒定/藥物敏感分析系統(tǒng)及配套的藥敏卡片進行菌株鑒定和藥物敏感性試驗，嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行操作[5]，藥物包括氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、復方磺胺甲噁唑、左旋氧氟沙星、青霉素、苯唑西林、利福平、萬古霉素、替考拉寧、紅霉素、克林霉素、利奈唑胺、莫西沙星、氨芐西林、慶大霉素、米諾環(huán)素。藥物敏感性結果依據(jù)美國臨床和實驗室標準化協(xié)會文件(CLSI M100，2018)進行判定。質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853和金黃色葡萄球菌ATCC25923，質(zhì)控菌株來源于美國菌種保藏中心。

1.2.3 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)法檢測金黃色葡萄球菌耐藥基因型采用MicroScan全自動細菌鑒定系統(tǒng)(購自美國貝克曼公司)鑒定出金黃色葡萄球菌；選取金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)菌落，金黃色葡萄球菌的溶葡萄球菌DNA裂解液和Taq Mix購自大連寶生物公司，依據(jù)DNA提取試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)說明書提取菌落基因組DNA。采用PCR法檢測金黃色葡萄球菌耐藥基因，PCR儀購自美國Bio-Rad公司?；騜laZ、mecA、ermA、ermB、ermC引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成(見表1)。20 μL反應體系：Taq Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性40 s，64 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。陽性參照基因：mecA(DNA提取自菌株ATCC43300)、blaZ(DNA提取自菌株ATCC43300)、ermA(DNA Tn554)、ermB(DNA Tn917)和ermB(DNA pE194)(菌株購自美國菌種保藏中心，DNA購自河南省細菌耐藥監(jiān)測中心)，純水作為陰性參照。將PCR擴增產(chǎn)物、陽性參照基因、陰性參照加入到含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中，110 V電泳40 min，使用Tanon-3500凝膠成像系統(tǒng)(購自上海天能公司)拍照。根據(jù)目的基因片段長度，參照陽性對照判讀菌株所含基因型。

表1 目的基因擴增引物

1.3 統(tǒng)計學處理應用WHONET 5.6軟件分析菌株分布及藥物敏感性數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1 患兒病原菌分布情況結果見表2?；純貉囵B(yǎng)的732份送檢標本中，分離出70株非重復首次分離菌株，包括17種細菌和1株真菌(未計入構成比)，其中革蘭陰性菌構成比為31.88%，主要為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌；革蘭陽性菌構成比為68.12%，主要為金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌和肺炎鏈球菌，其中以金黃色葡萄球菌構成比最高(26.08%)。

表2 患兒血培養(yǎng)病原菌分布

2.2 主要革蘭陰性菌對常用抗菌藥物的耐藥率結果見表3。大腸埃希菌對慶大霉素、環(huán)丙沙星、復方磺胺甲噁唑、左旋氧氟沙星有較高的耐藥率，對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星敏感。肺炎克雷伯菌對氨芐西林/舒巴坦和頭孢唑林有較高的耐藥率，對亞胺培南、美羅培南、阿米卡星敏感。銅綠假單胞菌對氨曲南有較高的耐藥率，對阿米卡星和左旋氧氟沙星敏感。

表3 主要革蘭陰性菌對常用抗菌藥物的耐藥率

2.3 主要革蘭陽性菌對常用抗菌藥物的耐藥率結果見表4。金黃色葡萄球菌對青霉素、紅霉素、苯唑西林有較高的耐藥率，對萬古霉素和利奈唑胺敏感。凝固酶陰性葡萄球菌對青霉素、苯唑西林、紅霉素有較高的耐藥率，對萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺敏感。肺炎鏈球菌對復方磺胺甲噁唑、紅霉素、克林霉素有較高的耐藥率，對利福平、萬古霉素、利奈唑胺、莫西沙星、左旋氧氟沙星敏感。腸球菌對青霉素、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、氨芐西林耐藥率較高，對萬古霉素、利奈唑胺和替考拉寧敏感。

表4 主要革蘭陽性菌對常用抗菌藥物的耐藥率

2.4 金黃色葡萄球菌耐藥基因分析結果見表5。18株金黃色葡萄球菌中，包括13株MRSA和5株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus，MSSA)。13株MRSA中mecA和ermA耐藥基因檢出率較高，其中有8株同時檢出耐藥基因mecA和erm基因(A或C)。5株MSSA中耐藥基因 blaZ 和ermC 檢出率較高。

表5 金黃色葡萄球菌耐藥基因檢測

3 討論

血流感染是重癥患者最嚴重的并發(fā)癥之一，患者發(fā)生血流感染后，機體各種生理和生物化學功能異常，平均住院時間延長，預后和轉歸較差。基礎疾病加重、全身炎癥反應綜合征、膿毒血癥所致感染性休克等均是血流感染患者病死率較高的影響因素[6]。

TSUZUKI等[7]研究發(fā)現(xiàn)，導致血流感染的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌中最常見的分別為金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌。本研究納入的69株細菌菌株中，革蘭陽性菌構成比為68.12%，革蘭陰性菌構成比為31.88%，其中構成比最高的是金黃色葡萄球菌(26.08%)，其次為凝固酶陰性葡萄球菌(21.74%)，再次是大腸埃希菌(11.59%)和肺炎鏈球菌(11.59%)；該結果與全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)中國兒童及新生兒患者細菌耐藥監(jiān)測研究結果一致[8]，提示金黃色葡萄球菌應為臨床感染重點關注病原菌之一。

本研究檢出的18株金黃色葡萄球菌中，對大環(huán)內(nèi)酯類藥物紅霉素的耐藥率高達77.78%；對喹諾酮類藥物莫西沙星和左旋氧氟沙星耐藥率較低，均為11.11%，但喹諾酮類藥物因可能對14歲以下兒童骨骼發(fā)育有影響而被限制使用；對萬古霉素的耐藥率為0.00%，因此，治療MRSA引起的兒童血流感染，萬古霉素應成為臨床首選用藥。提示對于金黃色葡萄球菌引起的血流感染臨床用藥可選擇的抗菌藥物種類極其有限。

本研究藥物敏感性試驗結果發(fā)現(xiàn)，主要革蘭陰性菌大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物美羅培南和亞胺培南的耐藥率為0.00%；對第3代頭孢類抗菌藥物頭孢曲松和頭孢他啶、第4代頭孢類抗菌藥物頭孢吡肟耐藥性也相對較低；提示對于革蘭陰性菌所致的血流感染可優(yōu)先考慮使用第3、4代頭孢類抗菌藥物，如果抗感染治療失敗，可選擇碳青霉烯類抗菌藥物進行治療。

本研究結果顯示，3株銅綠假單胞菌中對碳青霉烯類抗菌藥物美羅培南和亞胺培南、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑藥物哌拉西林/他唑巴坦耐藥率均為33.33%，對照患者的原始藥物敏感性試驗結果為同一株細菌，且此株細菌對單環(huán)類藥物氨曲南也耐藥。提示銅綠假單胞菌對3類結構不同的抗菌藥物均耐藥，呈現(xiàn)多重耐藥性。因此，對于銅綠假單胞菌引起的血流感染臨床用藥面臨困境，尤其對于兒童患者，需結合碳青霉烯類抗菌藥物的最低抑菌濃度值，考慮聯(lián)合用藥方案，如氨基糖苷類聯(lián)合碳青霉烯類；但氨基糖苷類抗菌藥物阿米卡星因具有耳毒性，新生兒盡量避免使用，嬰幼兒慎用，不得不考慮聯(lián)合用藥時要結合患兒的情況，最好進行血藥濃度檢測。

本研究分離出的18株金黃色葡萄球菌中包括13株MRSA和5株MSSA。徐衛(wèi)華等[9]研究發(fā)現(xiàn)，臨床上兒童發(fā)生金黃色葡萄球菌血流感染時應高度警惕 MRSA；相比于其他細菌感染，MRSA感染具有復雜的并發(fā)癥和更高的病死率[3]。在過去幾十年，大量文獻報道了MRSA所引起的感染[7，10-12]，具有多重耐藥基因的MRSA在社區(qū)和醫(yī)院出現(xiàn)的感染和流行成為全球主要健康問題，其可用藥物之少引起廣泛的關注。

MSSA在獲得耐甲氧西林的mecA基因后成為MRSA，mecA基因編碼表達異常的青霉素結合蛋白2a，可使大部分β-內(nèi)酰胺類藥物失去作用靶點，從而產(chǎn)生耐藥性[13]。blaZ基因可誘導細菌產(chǎn)生青霉素酶，從而分解進入細菌體內(nèi)的青霉素類藥物[14]。MRSA菌株若同時含有mecA基因和erm基因則會表達甲基鈍化酶，從而對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物呈現(xiàn)耐藥[15]。本研究中有8株MRSA mecA和erm(ermA或ermC)基因檢測均為陽性，說明該8株 MRSA產(chǎn)生了分解大環(huán)內(nèi)酯類藥物的甲基鈍化酶，易呈現(xiàn)多重耐藥性。

綜上所述，兒童血流感染最常見病原菌為金黃色葡萄球菌尤其是MRSA，臨床應重視病原菌的多藥耐藥性，合理應用抗菌藥物。臨床在經(jīng)驗用藥時，需考慮流行菌株特征，提高血培養(yǎng)送檢率，在獲得鑒定和藥物敏感性試驗結果后及時調(diào)整，精準用藥，并注意減少院內(nèi)感染。但本研究數(shù)據(jù)覆蓋面較小，研究對象所在醫(yī)院為非婦幼?？漆t(yī)院，兒科收治患兒病種有限，且兒科血培養(yǎng)送檢率相對其他科室低。因此，需要多中心的調(diào)查和研究，以了解本地區(qū)病原菌的分布和耐藥性，指導臨床針對兒童患者合理使用抗菌藥物。