桂林，梁春慧，于溯洋，程敏靜，卞紅磊

研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中存在Afadin蛋白磷酸化水平的改變[1]，與此同時(shí)，Afadin作為Akt的底物之一，其磷酸化狀態(tài)參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。在某些類型的腫瘤中，欖香烯能夠?qū)I3K/Akt信號(hào)通路的活性產(chǎn)生影響，上調(diào)或下調(diào)底物磷酸化水平[2]，由此推測(cè)，欖香烯可能也會(huì)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)Afadin的磷酸化水平產(chǎn)生影響，為了驗(yàn)證這種假設(shè)，現(xiàn)利用β-欖香烯對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞進(jìn)行處理，觀察細(xì)胞內(nèi)Afadin蛋白磷酸化水平的改變并分析其對(duì)細(xì)胞遷移以及侵襲的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細(xì)胞：結(jié)腸癌SW480細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。(2)藥品與試劑：β-欖香烯購(gòu)自石藥集團(tuán)遠(yuǎn)大制藥有限公司，重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)購(gòu)自R&D公司，2-嗎啉代-8-苯基色酮(LY294002)、兔抗人Afadin多克隆抗體及抗人磷酸化Afadin抗體購(gòu)自Abcam公司，兔抗人Akt 抗體和抗人磷酸化Akt 抗體購(gòu)自Cell Signaling 公司，內(nèi)參GAPDH抗體購(gòu)自Cst 公司，基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司，BCA蛋白定量試劑盒及ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。(3)儀器設(shè)備：Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)REVCO公司，BX53顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2019年10月—2020年1月于河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將SW480細(xì)胞分為6組。對(duì)照組：取復(fù)蘇后的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞10 ml(細(xì)胞濃度為5×106/ml)，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、含有5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；IGF-1組：細(xì)胞培養(yǎng)同對(duì)照組，培養(yǎng)基中加入IGF-1，使其最終濃度達(dá)到50 ng/ml；LY294002組：細(xì)胞培養(yǎng)同對(duì)照組，培養(yǎng)基中加入LY294002，使其最終濃度為10 μmol/L；欖香烯組：細(xì)胞培養(yǎng)同對(duì)照組，培養(yǎng)基中加入β-欖香烯，使其最終濃度達(dá)到20 μg/ml；欖香烯+IGF-1組：細(xì)胞培養(yǎng)同對(duì)照組，培養(yǎng)基中加入β-欖香烯及IGF-1，使其最終濃度分別達(dá)到20 μg/ml、50 ng/ml；欖香烯+ LY294002組：細(xì)胞培養(yǎng)同對(duì)照組，培養(yǎng)基中加入β-欖香烯及LY294002，使其最終濃度分別達(dá)到20 μg/ml、10 μmol/L，各組均培養(yǎng)72 h。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 Western-blot檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)Akt、磷酸化Akt、Afadin及磷酸化Afadin蛋白表達(dá)水平：從結(jié)腸癌細(xì)胞中提取總蛋白，BCA法蛋白定量，每組上樣20 μg，分離轉(zhuǎn)膜，1抗孵育過(guò)夜，2抗孵育1.5 h，ECL顯影，以GAPDH為內(nèi)參分別計(jì)算Akt、磷酸化Akt及Afadin、磷酸化Afadin的蛋白表達(dá)水平。

1.3.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力：在96孔板中加入結(jié)腸癌SW480細(xì)胞約3×104個(gè)，以次日細(xì)胞達(dá)到90%以上匯合度為準(zhǔn)，更換低濃度血清培養(yǎng)基，使用劃痕儀對(duì)準(zhǔn)96孔板的下端中央部位，向上輕推形成劃痕。使用無(wú)血清培養(yǎng)基輕輕漂洗2～3遍，拍照。在37℃、含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以96孔中心陰影區(qū)域?yàn)閰⒄眨瑒澓墼趫D片的正中進(jìn)行拍照。根據(jù)圖片計(jì)算各組細(xì)胞遷移率。

1.3.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力：每個(gè)小室中加入基質(zhì)膠50 μl，鋪勻，放置培養(yǎng)箱中孵育1～2 h。小心除去上室中培養(yǎng)基并加入細(xì)胞懸液100 μl(濃度為1×106/ml)，下室內(nèi)加入含有30% FBS的培養(yǎng)基600 μl。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，倒置小室于吸水紙上去除培養(yǎng)基，用棉拭子輕輕移去小室內(nèi)非轉(zhuǎn)移細(xì)胞，滴2～3滴吉姆薩染液到膜的下表面染色轉(zhuǎn)移細(xì)胞3～5 min，將小室浸泡沖洗數(shù)次，晾干。每個(gè)Transwell小室隨機(jī)選取視野于顯微鏡下拍照后計(jì)數(shù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組結(jié)腸癌細(xì)胞Akt、磷酸化Akt及Afadin、磷酸化Afadin蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，IGF-1組磷酸化Akt及磷酸化Afadin蛋白表達(dá)水平升高，LY294002組、欖香烯組上述蛋白表達(dá)水平降低；與欖香烯組比較，欖香烯+ICF-1組磷酸化Akt及磷酸化Afadin蛋白表達(dá)水平升高，欖香烯+LY294002組上述蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組結(jié)腸癌細(xì)胞Akt、Afadin蛋白表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組SW480細(xì)胞Akt、磷酸化Akt、Afadin及磷酸化Afadin蛋白表達(dá)水平比較

注：1.對(duì)照組；2.IGF-1組；3.LY294002組；4.欖香烯組；5.欖香烯+IGF-1組；6.欖香烯+ LY294002組圖1 各組SW480細(xì)胞Akt、磷酸化Akt及Afadin、磷酸化Afadin蛋白表達(dá)水平比較

2.2 各組結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力比較 與對(duì)照組比較，IGF-1組細(xì)胞遷移率升高，LY294002組、欖香烯組細(xì)胞遷移率降低；與欖香烯組比較，欖香烯+ICF-1組細(xì)胞遷移率升高，欖香烯+LY294002組細(xì)胞遷移率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖2。

圖2 各組SW480細(xì)胞遷移能力比較

表2 各組SW480細(xì)胞的遷移率與穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)量比較

2.3 各組結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力比較 與對(duì)照組比較，IGF-1組穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)量升高，LY294002組、欖香烯組穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)量降低；與欖香烯組比較，欖香烯+ICF-1組穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)量升高，欖香烯+LY294002組穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖3。

圖3 各組SW480細(xì)胞侵襲能力比較(箭頭所指系穿透基底膜的細(xì)胞)

3 討 論

β-欖香烯是從中藥莪術(shù)根莖中提取的萜烯類化合物，具有廣譜抗腫瘤作用[3-4]。在結(jié)腸癌領(lǐng)域，目前的研究主要集中在β-欖香烯對(duì)于凋亡、增殖、上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，特別是逆轉(zhuǎn)耐藥及放療增敏等方面[5-9]，對(duì)于β-欖香烯是否參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力，相關(guān)研究較少。本研究利用β-欖香烯對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行處理，然后通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移及侵襲能力變化，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)β-欖香烯處理的結(jié)腸癌細(xì)胞，其侵襲及遷移能力明顯減弱，提示欖香烯能夠抑制結(jié)腸癌的侵襲及遷移。

PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程發(fā)揮著重要的作用,通過(guò)Akt磷酸化水平變化，將信號(hào)傳導(dǎo)到下一級(jí)的效應(yīng)通路，廣泛調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬等生物學(xué)行為,其中也包括遷移及侵襲[10-12]。相關(guān)研究顯示，針對(duì)不同類型的腫瘤細(xì)胞，β-欖香烯會(huì)對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路產(chǎn)生截然不同的影響，例如對(duì)于腎細(xì)胞癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞及三陰乳腺癌細(xì)胞[13-15]，β-欖香烯會(huì)對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路產(chǎn)生抑制，降低磷酸化Akt的表達(dá)水平，由此產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡、抑制增殖及增強(qiáng)化療效果的作用。而對(duì)于肺腺癌PC9細(xì)胞及非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞來(lái)說(shuō)，應(yīng)用β-欖香烯處理卻會(huì)導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路活化，磷酸化Akt表達(dá)增加[16-17]，由此可見(jiàn)，β-欖香烯對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響具有一定的腫瘤類型特異性。在本研究中，分別使用β-欖香烯、PI3K/Akt信號(hào)通路激動(dòng)劑IGF-1和 Akt磷酸化非特異性抑制劑LY294002對(duì)SW480細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)β-欖香烯處理的結(jié)腸癌細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)Akt總量并沒(méi)有明顯變化，但是磷酸化Akt的蛋白表達(dá)水平卻明顯降低，顯示出與LY294002類似的結(jié)果，并且β-欖香烯能夠明顯抑制IGF-1對(duì)Akt的磷酸化，提示對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞，β-欖香烯對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的活性發(fā)揮抑制作用[18-19]。

研究顯示，細(xì)胞黏附連接關(guān)鍵蛋白Afadin可以作為底物被Akt磷酸化，從而調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞遷移與侵襲能力。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)β-欖香烯處理，伴隨著磷酸化Akt的蛋白表達(dá)水平降低，結(jié)腸癌細(xì)胞中磷酸化Afadin水平也明顯降低，結(jié)果再次證實(shí)，對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞來(lái)說(shuō)，Afadin蛋白的磷酸化狀態(tài)受Akt活性調(diào)控，而β-欖香烯能夠通過(guò)抑制Akt的活化，降低結(jié)腸癌細(xì)胞中Afadin蛋白的磷酸化水平。與此同時(shí)，本研究還顯示，應(yīng)用IGF-1能夠促進(jìn)磷酸化Akt及磷酸化Afadin的表達(dá)，增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷徙及侵襲能力，而應(yīng)用β-欖香烯或LY294002處理細(xì)胞，可以逆轉(zhuǎn)IGF-1的作用，在降低磷酸化Akt及磷酸化Afadin表達(dá)水平的同時(shí)，減弱結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力，結(jié)果提示，β-欖香烯能夠抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活化，進(jìn)而下調(diào)Afadin的磷酸化水平，由此發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及侵襲的作用。

綜上所述，β-欖香烯能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移與侵襲，其機(jī)制與β-欖香烯抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，從而導(dǎo)致Afadin蛋白磷酸化水平下調(diào)有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

桂林：設(shè)計(jì)研究方案，參與實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；梁春慧：實(shí)施研究過(guò)程，參與論文撰寫(xiě)；于溯洋：分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；程敏靜：資料搜集整理，論文修改；卞紅磊：課題設(shè)計(jì)，論文修改與審核