張峻愷綜述 汪健審校

隨著組織工程技術的快速發(fā)展，利用自組裝多肽作為支架材料與組織活體細胞進行結合，能很好地充當起細胞外基質的代替作用。作為生物領域材料的最新研究成果，它具有良好的材料—細胞界面的相容性、可降解性等特性而備受關注。

1 自組裝多肽概述

自組裝多肽具有良好的生物相容性和生物降解性，通過合理調控多肽的分子結構及改變外界的環(huán)境，多肽分子可利用非共價鍵作用力自組裝形成納米纖維結構，進而形成水凝膠。天然或者合成的肽及其偶聯物的自組裝納米結構具有精確的選擇性和多功能等優(yōu)點，并且由于其在能源、生物醫(yī)學和納米技術方面的巨大應用潛力而引起了人們的極大關注。由氨基酸組成的多肽是最受歡迎的構件和可編程的分子基序之一。利用多肽組裝的納米結構和材料由于其生物友好性和可逆性，在綠色生命、新技術和生物醫(yī)學應用方面顯示出重要的潛力。自組裝多肽是一類越來越受歡迎的生物學材料。作為最受生物啟發(fā)的構件，多肽在新出現的納米技術和生物醫(yī)學中的先進材料和應用方面引起了越來越多的關注[1]。當前自組裝多肽的納米顆粒已經成為生物醫(yī)學應用的強大工具，尤其是在骨、神經血管再生中的應用，并且可以診斷出微小的器官病變，使疾病的預防成為可能[2]。

2 自組裝多肽的結構與特性

氨基酸之間的相互作用使復雜的自組裝納米結構得以發(fā)展。自組裝多肽包括短氨基酸序列或重復氨基酸序列的單體組裝成的納米結構肽組裝體，表現出獨特的物理化學和生化活性。肽可以設計成具有特定性質的不同超分子納米結構。經過設計的具有α-螺旋或β-折疊二級結構的多肽和兩親性肽單體在自組裝成超分子組裝方面顯示出很好的前景[3]。多肽的自組裝是通過范德華、靜電、氫鍵作用和π-π堆積作用使分子利用自由能驅動的過程自發(fā)地組織成有序結構[4]。因此，氨基酸的不同性質可在肽的設計中進行操縱，以啟動自組裝，從而產生新的功能生物材料。生物分子的自組裝是指在沒有外源引導的情況下，通過自下而上的方法及非共價相互作用將其結合成有序的三維結構的能力。自組裝在自然系統中普遍存在，并且是在活細胞中產生如DNA雙螺旋和蛋白質折疊，與各種非共價相互作用有關。自組裝在自然界中是一個重要的過程，多項研究在創(chuàng)造增強型生物醫(yī)學材料方面利用了這種過程[5]。肽自組裝作為一種制備方法，具有各種構象，如α-螺旋和β-折疊?？梢杂糜谥圃鞆募{米尺度的納米管到宏觀尺度的纖維束等各種結構[6]。在α-螺旋到β-折疊的二級結構轉變對于通過抑制β-折疊聚集來治療神經系統疾病和在細胞外基質中應用α-螺旋纖維如三鏈膠原、藥物傳遞和控制釋放及組織工程都具有重要的意義[7]。

3 自組裝多肽在再生醫(yī)學中的應用

3.1 骨與軟骨 創(chuàng)傷性骨缺損與退行性關節(jié)軟骨缺損需要修復，組織工程的出現，不僅給骨缺損和軟骨缺損的再生提供了很好的生物相容性支架，而且還為細胞分布和細胞外基質(ECM)積累提供模板。自組裝多肽是一種人工合成的生物材料，并且具有與細胞外基質相類似的的納米纖維結構，使用自組裝多肽水凝膠可以最大限度地減少生物污染的風險和不確定因素的影響，骨形成所必需的因素包括成骨細胞等細胞，自組裝多肽水凝膠是可以支持這些細胞黏附和移動的細胞外基質[8-9]。作為一種新型可注射的生物材料，自組裝多肽水凝膠具有以上成骨所需要的必要因素，已在實驗中證實海藻酸鈉與FmocFF多肽相結合的水溶膠具有誘導成骨分化和促進鈣化的作用[10]。自組裝多肽BMSCs-RADA16 復合體顯著促進了小鼠成骨細胞的增殖、分化和遷移，并且在實驗中也發(fā)現BMSCs-RADA16復合體的成骨基因表達顯著提高[11]。將D-RADA16多肽水凝膠包裹在加入了堿性成纖維細胞生長因子的納米人工骨上，不僅降低了水凝膠的降解率，還延長了bFGF的緩釋時間，從而更好地促進骨愈合和保持良好的骨愈合性能[12]。另一項研究中使用SPG-178與PEEK組成混合支架，彌補了水凝膠強度的不足并且能夠滿足成骨要求，將其注入大鼠股骨缺損模型中，通過影像學驗證，在缺損處新骨基質形成程度顯著增高。在整個研究過程中，空洞的缺損基本上沒有任何礦化組織，模型缺損的大小是臨界的，即在研究的長度內無法愈合[13]。

骨髓間充質干細胞(MSCs)可在轉化生長因子(TGF)誘導下并在顆粒培養(yǎng)中促進軟骨形成[14]。一種多肽兩親性分子的共組裝系統，該系統通過顯示高密度的轉化生長因子-β1(TGF-β1)結合表位來形成用于軟骨再生的納米纖維軟骨的修復，體外實驗表明，這些材料支持人骨髓間充質干細胞的存活并促進其向軟骨細胞分化，而且在兔的軟骨缺損模型中證實可以促進軟骨的再生[15]。利用RADA-16肽的自組裝合成水凝膠注入小鼠模型中觀察到其結構有利于軟骨細胞的嵌入和關節(jié)軟骨的再生，并且伴隨的炎性反應比非生物凝膠更低。由此說明自組裝多肽水凝膠可用于組織再生的細胞培養(yǎng)支架[16]。

3.2 神經系統 由于神經細胞不能進行再生或再生能力極弱的特性，神經元組織的再生及其修復是困難的。在體內若神經受到創(chuàng)傷性損傷，神經細胞難以分化再生。

神經組織再生能力差，在創(chuàng)傷性腦損傷或神經退行性病變后可導致永久性腦損傷。但組織學工程出現給神經損傷帶來了治療策略。在過去的幾十年里，干細胞在腦外傷治療中的應用引起了人們極大的興趣。移植各種人類干細胞作為自體細胞來源，種植在納米支架中，可改善不同神經系統損傷動物模型的腦結構修復和功能恢復[17-18]。神經干/祖細胞(hNS/PC)和人脂肪間充質干細胞(hADSCs)、人腦膜瘤干細胞具有增殖和分化為神經元和膠質細胞的潛能。在大鼠急性創(chuàng)傷性腦損傷模型中，自組裝多肽納米纖維支架——RADA4GGSIKVAV(R-GSIK)，將人腦膜瘤干細胞種植到該支架中，并將含有人腦膜瘤干細胞納米纖維支架移植到創(chuàng)傷性腦損傷的動物模型中，減少了損傷部位炎性反應過程和反應性膠質增生，減少了細胞凋亡，顯著改善了腦功能的恢復[19]。將癲癇患者腦來源的hNS/PC和hADSCs種植在PuraMatrix水凝膠(PM)中，并在腦損傷大鼠模型中證實可促進腦外傷大鼠功能恢復，減少病灶體積，抑制炎性反應，減少損傷部位的反應性膠質增生，是一種可用于神經疾病(如頑固性癲癇)的潛在細胞治療[20]。

在脊髓損傷后會形成充滿液體的嚢腔并且出現炎性反應和形成膠質限制了神經再生。但利用多肽納米纖維之間的結構微環(huán)境與電荷誘導的作用，并加入生長因子，實現了可持續(xù)釋放生長因子，這種人造的生物微環(huán)境誘導了軸突的再生并調節(jié)了局部的炎性反應[9]。不論是體內還是體外實驗，將微血管細胞移植到自組裝多肽RADA16-I中，在肽支架內都形成了緊密連接的血管系統，從而產生了血—脊髓屏障。并觀察到移植或損傷部位的軸突密度增加，證明其在治療脊髓損傷中的潛力[21]。自組裝多肽凝膠SPG-178在體外可促進運動神經元突起生長，增加NGF、BDNF、NT-4、TrkA和TrkB的表達，在體內應用SPG-178可減少炎性反應和膠質瘢痕形成，為SPG-178作為支架通過誘導神經保護因子治療脊髓提供了新的證據[22]。

周圍神經迅速再生才能恢復神經和肌肉的功能，所以周圍神經再生也備受關注。干細胞是周圍神經系統的主要支持細胞，在軸突再生中起著重要作用。一項選擇大鼠干細胞作為研究對象評價細胞在不同支架上的黏附、增殖和功能基因表達模式研究表明，具有仿生細胞識別功能的多肽共電紡支架植入納米結構對干細胞的增殖功能具有積極作用，這些支架隨后可通過促進軸突再生和功能性神經恢復來修復周圍神經缺損[23]。另一項研究使用RADA16-I多肽作為支架，并將腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)衍生的神經營養(yǎng)肽(RGIDKRHWNSQ)引入RADA16-I的C末端，得到了RAD-RGI功能化自組裝多肽水凝膠。大鼠坐骨神經損傷模型研究表明，功能化多肽RAD/RGI水凝膠不僅為軸突再生和支持膠質細胞生長提供了適宜的微環(huán)境，而且有協同促進周圍神經功能恢復的作用[24-25]。

3.3 心血管系統 在血管組織工程中，增強內皮細胞的活性，如黏附、排列、生長和分化，是血管再生成功的關鍵目標。多功能自組裝多肽在血管組織再生中也是有效的，可作為支架影響細胞的排列、黏附和分化，并促進更好的內皮化[26]。血管內皮生長因子(VEGF)是一種眾所周知的生長因子，在血管生成中具有重要作用。利用人骨髓間充質干細胞(hMSCs)與人臍靜脈內皮細胞(GFP-HUVECs)在細胞黏附配體RGDS功能化的自組裝多肽(PA-RGDS)兩親納米基質上共培養(yǎng)，結果表明PA-RGDS納米基質與hMSCs共培養(yǎng)時VEGF基因表達上調，VEGF分泌增加，呈網狀結構，提示hMSCs與HUVECs和PA-RGDS協同作用促進血管生成[27]。Qi等[28]設計并合成了一種新的糖肽分子，并使其轉化為糖肽透明的水凝膠(即GP凝膠)，摻入促血管生成因子(DFO)，自組裝的GP凝膠在體外可作為可持續(xù)釋放DFO和誘導內皮細胞毛細血管形態(tài)發(fā)生的儲存庫。在動物模型中包裹DFO的自組裝GP凝膠可在體內觸發(fā)新的毛細血管生成。在臨床中，心肌梗死可造成心肌損傷，而心肌細胞再生能力有限，但心臟組織工程的出現，讓人們看到了其潛在的能力。以往研究表明，自組裝多肽可注射至心肌中來創(chuàng)造三維微環(huán)境，在微環(huán)境中血管平滑肌細胞被募集，并可能形成功能性的血管結構，并且注射的三維支架在心肌內組裝成體內的微環(huán)境不會導致主要的炎性反應[29]。目前在大鼠心肌梗死模型中將RADA-SDKP自組裝多肽水凝膠注入其中作為細胞支架載體，之后在模型中觀察到微血管的擴張再通，大鼠左心室射血分數(LVEF)明顯改善[30]。通過將來自血管生成素-1的生存肽QHREDGS連接到已知的自組裝多肽 RADA16-I上，所形成的多功能自組裝多肽——DSAP,將MSCs移植到DSAP中并注入至大鼠心肌梗死模型中，結果表明DSAP-MSC注射液能改善心功能，減少梗死面積、膠原含量和細胞凋亡[31]。綜上，自組裝多肽的一個強大優(yōu)勢是，它們可以被設計成整合生長因子和其他信號，這些信號為治療心血管系統疾病提供了新的途徑和策略。

4 自組裝多肽在癌癥治療中的前景

化療是一種較為成熟的傳統癌癥治療方法。但化療藥物非選擇性對于健康細胞也會造成一定的損害，為了將非選擇性不良反應降到最低，化療中可使用特定的肽序列或基序。設計成納米粒子的肽在化療中用于靶向癌細胞表面或腫瘤血管，可將全身藥物不良反應降至最低，并提高效率。作為藥物載體，自組裝多肽具有許多優(yōu)點，如載藥效率高，藥物損失率低，穩(wěn)定性高，避免了體內清除[32-33]。

腫瘤組織中的細胞過程如生存、增殖、轉移，在這些細胞過程中肌動蛋白骨架作用是至關重要的。根據這一機制可以設計出針對破壞肌動蛋白細胞骨架的靶向分子組合體，可特異性地靶向和破壞腫瘤肌動蛋白細胞骨架，通過其在癌細胞膜上所形成的納米結構域，可選擇性地針對多種類型癌細胞。其機制是通過肌動蛋白細胞骨架實現下游癌細胞的滯留，有效抑制了癌細胞的侵襲和轉移，從而達到腫瘤的治療作用[34-35]?？赊D化肽——BP-FFVLK-YCDGFYACYMDV可在一定條件下組裝成納米顆粒，與癌細胞上的表皮生長因子受體(HER2)結合后轉化為納米纖維并阻止了下游細胞信號傳遞及細胞核中增殖和生存基因的表達，這些基于結構轉化的超分子肽代表了一類受體介導的抗癌靶向納米療法[36]。

在乳腺癌治療中光熱療法(PTT)和光動力療法(PDT)，表現出空間選擇性高、非侵襲性和耐藥性可忽略不計等優(yōu)點，Wan等[37]將TAT肽與具有PTT和PDT抗癌功效的近紅外熒光染料——IR780偶聯，形成TAT-IR780 并與化療藥物阿霉素(DOX)在水介質中形成TID納米顆粒，TID納米粒子具有良好的腫瘤穿透能力，能有效地將IR780和DOX導入癌細胞，并且可有效地介導IR780和DOX的協同抗癌作用。另一種多功能肽P51與化療藥物吡柔比星(THP)自組裝形成P51-THP納米粒，并且已證實該納米顆粒在達到腫瘤組織之前其傳遞系統是完整的，完整的P51-THP納米粒在體內很難進入細胞核，有利于減少化療藥物的毒副作用，并且腫瘤微環(huán)境的多重釋放觸發(fā)器可能通過增加藥物釋放而在腫瘤靶向治療中發(fā)揮關鍵作用[38]。P51-THP與TID納米顆粒就是化療藥物與多肽結合所形成的藥物輸送納米顆粒，并且其可靶向性地將化療藥物導入癌細胞發(fā)揮抗腫瘤效果，同時降低了化療藥物的全身毒性，這種將化療藥物與多肽結合并靶向性輸送至癌細胞中是治療癌癥的一種潛在療法。

在腫瘤的診斷上，一種成纖維細胞激活蛋白-α(FAP-α)反應肽的近紅外探針可在腫瘤相關成纖維細胞(CAF)表面特異性地原位形成納米纖維，注入后可造成CAF的蓄積和滯留，提高了成像靈敏度，可獲得2 mm小腫瘤的近紅外成像，給NIR、MIR、PET/CT等提供了一種可擴展的成像探針設計，有助于提高腫瘤診斷能力[39]。

5 自組裝多肽的其他用途

目前已經出現了許多多重耐藥微生物，給人類的健康及經濟增加了許多的負擔，但抗菌肽的出現給這一問題帶來了希望?？咕囊呀洷徽J為是對抗耐藥微生物的新武器，其具有良好的廣譜抗菌活性和抗生物膜能力。以革蘭陰性大腸桿菌、革蘭陽性金黃色葡萄球菌和白色念珠菌為例，不同結構的多功能自組裝抗菌肽對其都有抗菌性和抗生物膜性，甚至有的抗菌肽還表現出比抗生素更好的抗菌效果[40]。

血腦屏障是在藥物給予過程中遇到的一項最具有挑戰(zhàn)性的生物膜，它不僅阻止了有害物質進入大腦，同時也阻止了治療藥物的進入。隨著自組裝多肽的發(fā)展，研究人員將細胞穿透肽HIV-1反式激活轉錄子(TAT)進行組裝，該肽被認為可以穿透細胞的質膜，這表明它可作為載體運送藥物。并且將TAT肽與兩性離子納米凝膠偶聯形成TAT-nBSA納米顆粒，并證實了其可用于血腦屏障的跨越[41]。另一項研究中，二苯丙氨酸納米組裝體完全抑制細菌生長，其作用機制是引起膜滲透和去極化，對細菌形態(tài)造成實質性破壞。

RADA16自組裝多肽水凝膠用于抗菌陽離子肽(AMPs)的遞送外，體外研究表明，這種新型自組裝水凝膠能促進骨髓間充質干細胞(BMSCs)的增殖，抑制金黃色葡萄球菌的生長及可以釋放到治療后28 d[42]。Liu等[43]設計了一種兩親性短肽(CG3R6TAT)，它包含一個細胞穿透肽TAT的親水塊和6個精氨酸殘基(R6或Arg6)及一個疏水性的膽固醇(C)塊，并且證實此納米顆粒對細菌、耐藥細菌、酵母和真菌都有很強的抗菌效果，并且在兔腦膜炎模型中驗證該肽納米顆粒能夠穿過血腦屏障，并抑制腦部細菌的生長，重要的是，它們不會對主要器官造成明顯的毒性，表明這些納米顆粒可能在治療腦部感染方面提供一種有效的抗菌劑。這些研究結果證實了自組裝抗菌構件的重要性，并且引發(fā)了人們對抗菌劑和生物材料的關注，為抗菌藥物和生物材料的結合提供了方法和設計原則。

6 自組裝多肽應用中優(yōu)缺點

自從自組裝多肽水凝膠被發(fā)現并在組織工程中應用以來，其具有以下幾個特點[44-45]：(1)其自身擁有天然的氨基酸成分且是一種納米結構材料，具有很好的功能材料特點；(2)溶于無菌離子水后所形成的水凝膠既可以注射并又可在蛋白酶中完全降解，大大降低了異物排斥反應；(3)自組裝多肽是一良好的生物學材料，較其他傳統材料相比具有更好的生物相容性，并且具有更好的細胞生存三維結構；(4)自組裝多肽的片段可以適當的調整成為所需要的納米纖維功能材料，自組裝多肽在骨再生醫(yī)學的應用時，對于小面積的組織缺損有很好的功能支撐作用，但在面積較大的缺損和/或承載骨缺損時其功能支撐作用并不理想[45]。

7 結論與展望

自從自組裝分子這一概念提出來以后，近幾十年內科學家們對這一領域產生了濃厚的興趣，通過多學科的共同努力，自組裝多肽可以幫助研究復雜的生物現象，創(chuàng)造各種應用。在體內動物模型及體外培養(yǎng)實驗都得到了許多令人興奮的發(fā)現，顯示了其在人體組織修復方面的巨大潛力。組織工程的進展十分迅速，但仍有一些困難需要去攻克，如在具有三維結構水凝膠的機械化不是很穩(wěn)定。另外，對這一新型生物材料來說，如何設置其全面的監(jiān)測系統，如自組裝多肽與其他材料或藥物的整合中，在組織再生中能控制其修復及損傷的靶點，需要人們積極地尋求新的治療方法，例如是否能在一種主要修復骨再生多肽上加其他具有不同功能的多肽小片段和/或生長因子，使其具有成骨的特性及其他特性(如成血管等)，使其成為一個復合體，這樣在運用于組織再生時具有可控的生物靶向特點。這些困難和挑戰(zhàn)將推動該領域的發(fā)展。