白萬(wàn)富 劉玉鍵 李想 王朋 常虹 郝海梅 白迎春 劉全禮 石松利

摘 要 目的：初步探討蒙藥掃日勞-4味湯對(duì)特發(fā)性肺纖維化模型大鼠的改善作用及機(jī)制。方法：將雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（吡非尼酮，0.163 g/kg）和掃日勞-4味湯低、中、高劑量組（0.899、1.798、3.596 g/kg），每組8只。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均按5 mg/kg于氣管內(nèi)緩慢注射6 mg/mL博來(lái)霉素1次以復(fù)制特發(fā)性肺纖維化模型。從建模后的第1天起，正常對(duì)照組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，其余各組大鼠灌胃相應(yīng)藥液，每天1次，給藥體積均為10 mL/kg，連續(xù)給藥4周。實(shí)驗(yàn)期間，觀察各組大鼠的一般情況并稱定其體質(zhì)量。末次給藥24 h后，觀察各組大鼠肺的外觀形態(tài)，采用蘇木精-伊紅和Masson染色觀察肺組織形態(tài)學(xué)特征，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定其血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，肺組織中羥脯氨酸（HYP）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6、透明質(zhì)酸酶（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PC-Ⅲ）、Ⅳ型膠原（Col-Ⅳ）含量，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)測(cè)定其肺組織中轉(zhuǎn)化生成因子β1（TGF-β1）、Smad3、Smad7 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠活動(dòng)、毛發(fā)、飲食等均有明顯改善，末次給藥后的體質(zhì)量均顯著升高，肺組織病理改變和肺纖維化特征均明顯改善，血清中SOD活性顯著升高，血清中MDA含量（掃日勞-4味湯中劑量組除外）和肺組織中HYP（掃日勞-4味湯高劑量組除外）、IL-1β、IL-6、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ（掃日勞-4味湯高劑量組除外）含量以及TGF-β1、Smad3 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，Smad7 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：掃日勞-4味湯可以顯著改善特發(fā)性肺纖維化模型大鼠肺部病理改變，延緩并逆轉(zhuǎn)肺纖維化進(jìn)展，其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)，改善脂質(zhì)過(guò)氧化，下調(diào)TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)，上調(diào)Smad7 mRNA表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 特發(fā)性肺纖維化;蒙藥;掃日勞-4味湯;炎癥因子;氧化應(yīng)激;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/Smad信號(hào)通路;大鼠

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To preliminarily investigate the improvement effects and mechanism of Mongolian medicine Saorilao-4 decoction on specific pulmonary fibrosis model rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into normal control group， model group， positive control group （pirfenidone， 0.163 g/kg） and Saorilao-4 decoction low， medium and high dose groups （0.899， 1.798， 3.596 g/kg）， 8 rats in each group. Except for normal control group， other groups were given 6 mg/mL bleomycin intratracheally at 5 mg/kg once to induce the specific pulmonary fibrosis model. From the first day after modeling， normal control group and model group were given normal saline intragastrically， other groups were given corresponding drugs intragastrically， once a day， 10 mL/kg， for 4 weeks. During the experimental period， the general condition of the rats in each group was observed and the body mass was weighed. Twenty-four h after last medication， the appearance morphology of rat lung in each group were observed. The morphological characteristics of lung tissues were observed by HE and Masson staining. ELISA was adopted to determine the activity of SOD and the content of MDA in serum， the contents of hydroxyproline （HYP）， IL-1β， IL-6， hyaluronidase （HA）， laminin （LN）， precollagen type Ⅲ （PC-Ⅲ） and collagen type Ⅳ （Col-Ⅳ） in lung tissue. RT-PCR was used to determine the mRNA expression of TGF-β1， Smad3 and Smad7 in lung tissue. RESULTS： Compared with model group， the activity， hair and diet of the rats in each dose group of Saorilao-4 decoction and positive control group were significantly improved， and the body mass after the last administration was significantly increased; the pathological change of lung and pulmonary fibrosis were significantly improved， and the activity of SOD in serum was increased significantly. Serum content of MDA （except for Saorilao-4 decoction medium dose group）， the contents of HYP （except for Saorilao-4 decoction high dose group）， IL-1β， IL-6， HA， LN， PC-Ⅲ， Col-Ⅳ （except for Saorilao-4 decoction high dose group） as well as mRNA expression of TGF-β1 and Smad3 in lung tissue were significantly decreased; mRNA expression of Smad7 was significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Saorilao-4 decoction can significantly improve the lung pathological changes， delay and reverse the progression of pulmonary fibrosis in specific pulmonary fibrosis model rats， the mechanism of which may be related to the inhibition of inflammatory response， improvement of lipid peroxidation， down-regulation of TGF-β1 and Smad3 mRNA expression， and up-regulation of Smad7 mRNA expression.

KEYWORDS ? Specific pulmonary fibrosis; Mongolian medicine; Saorilao-4 decoction; Inflammatory factors; Oxidative stress;TGF-β1/Smad signaling pathway; Rats

特發(fā)性肺纖維化是一組病因不明且以肺間質(zhì)彌散性滲出、浸潤(rùn)和纖維化為主要病變的疾病，醫(yī)學(xué)上將其歸屬為肺間質(zhì)疾病，主要癥狀為進(jìn)行性呼吸困難、氣短、干咳、喘憋，最終可導(dǎo)致患者呼吸衰竭，甚至造成死亡，病死率達(dá)50%～70%，是許多肺部疾病發(fā)展、演變、疤痕化的最終結(jié)局[1-2]。已有研究表明，肺纖維化患者預(yù)后很差，大部分被確診的特發(fā)性肺纖維化患者的平均生存期僅有3～5年，5年生存率僅為20%[3-4]。但目前，臨床治療肺纖維化的方法和藥物十分有限，故研究與開(kāi)發(fā)治療肺纖維化的有效藥物就顯得尤為重要。

蒙藥掃日勞-4味湯出自《醫(yī)法海鑒》，別名有四味沙參湯、查干掃日老-4湯等，是由北沙參（別名查干-掃日勞、查干蘇如老）、甘草、拳參、紫草茸等藥材經(jīng)混合、研磨制成的湯劑[5]。該方具有清熱、止咳作用，主治肺熱、氣喘、咳嗽、痰成黃色或帶血、血熱引起的肺部作痛、感冒等癥[6]。掃日勞-4味湯方中，以味甘苦、性涼柔而有清肺熱、止咳作用的北沙參為主，以清血熱及肺熱的紫草茸為輔，佐以甘草以止咳祛痰，拳參以清肺熱、解毒，故本方為治療肺熱病及各種熱型咳嗽的常用方[7]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）/Smad信號(hào)通路參與了特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。TGF-β1在纖維化的肺組織中表達(dá)增加，并能影響細(xì)胞外基質(zhì)沉積[8]。Smad蛋白家族是TGF-β1的下游底物分子[9]。在纖維化發(fā)展過(guò)程中，膠原蛋白沉積需依賴于Smad3，故Smad3被認(rèn)為是各種促纖維化信號(hào)的最終整合因子[9]。Smad7可調(diào)節(jié)肺損傷修復(fù)過(guò)程中TGF-β1的異常表達(dá)，從而抑制肺纖維化進(jìn)程[10]。本課題組前期對(duì)多種治療呼吸系統(tǒng)疾病的蒙藥現(xiàn)用方劑進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，掃日勞-4味湯具有抑制肺纖維化的作用。在此基礎(chǔ)上，本文擬利用特發(fā)性肺纖維化大鼠模型，探討掃日勞-4味湯對(duì)模型大鼠肺纖維化、炎癥因子、抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響，并結(jié)合肺組織形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)方法，研究該方抗特發(fā)性肺纖維化的藥效學(xué)特征及對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期為深入研究掃日勞-4味湯對(duì)特發(fā)性肺纖維化的改善作用及其具體機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本文所用主要儀器包括7500型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國(guó)AB公司）、Vlultifuge X1R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和Nanodrop2000型微量分光光度儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、CX31型光學(xué)顯微鏡和AU640型全自動(dòng)生化分析儀（日本Olympus公司）、BSA124S-CW型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）、K4896-B型快速混勻器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）、DZW-型水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、TGL-16M型冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）、Multiskan GO型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限責(zé)任公司]、TDZ4-WS型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、MS-700型研磨機(jī)（寧波美善美心電器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

掃日勞-4味湯（批號(hào)20200414，規(guī)格每袋3 g，北沙參-甘草-拳參-紫草茸的質(zhì)量比5 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 3）購(gòu)自內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院國(guó)家蒙藥制劑中心;吡非尼酮膠囊（陽(yáng)性藥物，批號(hào)20200711，規(guī)格100 mg）購(gòu)自北京康蒂尼藥業(yè)有限公司;注射用博來(lái)霉素（批號(hào)SL30191404，規(guī)格100 mg/mL）購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)20191231）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;Masson染液（批號(hào)20191025）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)20201104）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號(hào)20201105）、羥脯氨酸（HYP）試劑盒（批號(hào)20201029）、總蛋白定量測(cè)定試劑盒（批號(hào)20201029）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）試劑盒（批號(hào)CK-E30206）、IL-6試劑盒（批號(hào)CK-E30219）、透明質(zhì)酸酶（HA）試劑盒（批號(hào)CK-E30811）、層粘連蛋白（LN）試劑盒（批號(hào)CK-E30254）、Ⅲ型前膠原（PC-Ⅲ）試劑盒（批號(hào)CK-E31310）、Ⅳ型膠原（Col-Ⅳ）試劑盒（批號(hào)CK-E34380）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;Trizol試劑盒（批號(hào)U8926）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;熒光定量PCR試劑盒（批號(hào)30537）購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;氯化鈉注射液（批號(hào)2012056G，規(guī)格200 mL，1.8 g，作生理鹽水用）購(gòu)自山東華魯制藥有限公司;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

健康成年雄性SPF級(jí)SD大鼠48只，體質(zhì)量180～250 g，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2017-0005。飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)狀況良好，室溫為22～27 ℃，相對(duì)濕度為（50±5）%。所有大鼠均自由攝食、飲水。

2 方法

2.1 分組與造模

將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（吡非尼酮，0.163 g/kg，根據(jù)說(shuō)明書(shū)規(guī)定劑量并按體表面積[11]換算所得）和掃日勞-4味湯低、中、高劑量組（0.899、1.798、3.596 g/kg，根據(jù)說(shuō)明書(shū)規(guī)定劑量并按體表面積[11]換算得中劑量，低、高劑量分別為中劑量的0.5和2倍），每組8只。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均按5 mg/kg于氣管內(nèi)緩慢注射6 mg/mL博來(lái)霉素1次以復(fù)制特發(fā)性肺纖維化模型[12-14]。若大鼠肺組織受損面積大于50%則表示特發(fā)性肺纖維化模型成功[15]。

2.2 給藥

從建模后的第1天開(kāi)始，正常對(duì)照組和模型組大鼠分別灌胃等體積生理鹽水，各藥物組大鼠分別灌胃相應(yīng)劑量的藥液（均以生理鹽水為溶劑），每天1次，給藥體積均為10 mL/kg，連續(xù)給藥4周。

2.3 大鼠一般情況觀察

觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組大鼠的活動(dòng)、毛發(fā)、飲食、體質(zhì)量等一般情況。

2.4 大鼠肺的外觀形態(tài)觀察與樣品采集

于末次給藥24 h后處死各組大鼠，立即觀察其雙肺的顏色、質(zhì)地、形態(tài)、體積等外觀變化;然后于腹主動(dòng)脈取血5 mL，分離血清或血漿并于-80 ℃下冷藏，備用;取左肺下葉組織適量，用4%多聚甲醛溶液固定，備用;取右肺組織適量，經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃下冷藏，備用。

2.5 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化觀察

取各組大鼠經(jīng)固定的左肺下葉組織，制成病理切片并進(jìn)行HE、Masson染色[16-17]。將染色后的切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化，記錄結(jié)果并進(jìn)行病理評(píng)分。根據(jù)病變程度分別賦分：0分，HE染色結(jié)果顯示（下同）受損面積為0;1分，受損面積小于25%;2分，受損面積為26%～50%;3分，受損面積為51%～75%;4分，受損面積大于75%[15]。

2.6 大鼠氧化和纖維化相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

取各組大鼠血清和右肺組織適量，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）以酶標(biāo)儀測(cè)定血清中SOD活性、MDA含量和肺組織中HYP含量，根據(jù)相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.7 大鼠肺組織中炎癥因子和纖維化相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

取各組大鼠右肺組織適量，采用ELISA法以酶標(biāo)儀測(cè)定肺組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和纖維化相關(guān)指標(biāo)HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ含量，根據(jù)相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.8 大鼠肺組織中TGF-β1/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)測(cè)定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行測(cè)定。取各組大鼠右肺組織適量，采用Trizol法提取總RNA，以微量分光光度儀測(cè)定RNA的濃度后，將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)方法配制反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)體系（50 μL）包含2×Real SYBR Mixture 25 μL，10 ?mol/L上、下游引物各1 μL，cDNA模板 2 μL，ddH2O加至50 μL。按如下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸20 s，72 ℃再延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）報(bào)道的TGF-β1、Smad3和Smad7的引物序列，應(yīng)用DNASTAR 12.1軟件設(shè)計(jì)并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列與產(chǎn)物長(zhǎng)度詳見(jiàn)表1。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TGF-β1、Smad3和Smad7 mRNA的表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般情況

正常對(duì)照組大鼠攝食飲水正常，能夠正常行動(dòng)，雙眼有神，皮毛柔順。模型組大鼠攝食飲水日漸減少，行動(dòng)遲緩，目光呆滯，皮毛粗糙、脫落嚴(yán)重，行為懶散，身體機(jī)能有明顯下降，主要表現(xiàn)為肢體協(xié)調(diào)性差、動(dòng)作不靈敏。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的上述癥狀和表現(xiàn)均明顯好轉(zhuǎn)。

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠末次給藥后的體質(zhì)量顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠末次給藥后的體質(zhì)量均顯著升高（P<0.01），詳見(jiàn)表2。

3.2 大鼠肺的外觀形態(tài)變化

正常對(duì)照組大鼠肺鮮紅，質(zhì)地均一柔軟。模型組大鼠肺成棕褐色且腫脹，纖維化嚴(yán)重，質(zhì)地偏硬，有斑點(diǎn)，色澤不均勻。掃日勞-4味湯各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺顏色和質(zhì)地均有明顯改善，其中陽(yáng)性對(duì)照組和掃日勞-4味湯低劑量組改善較明顯，詳見(jiàn)圖1。

3.3 大鼠肺組織的形態(tài)學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁上皮細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量正常，肺泡間隔正常未見(jiàn)增厚，肺間質(zhì)無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，部分肺泡壁塌陷、融合，肺泡壁上皮細(xì)胞形態(tài)破壞、不規(guī)則、數(shù)量明顯減少，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)可見(jiàn)增生及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其病理評(píng)分顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)、肺泡壁上皮細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量及肺間質(zhì)炎癥程度均明顯改善，其病理評(píng)分均顯著降低（P<0.01），其中掃日勞-4味湯低劑量組大鼠的病理評(píng)分顯著低于掃日勞-4味湯中、高劑量組（P<0.05），詳見(jiàn)圖2、表3。

Masson染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔未見(jiàn)增厚，肺間質(zhì)無(wú)明顯藍(lán)紫色膠原纖維沉積。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)可見(jiàn)大量片狀藍(lán)紫色膠原纖維沉積。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)、肺泡間隔、肺間質(zhì)炎癥程度及膠原纖維沉積程度均明顯改善，其中掃日勞-4味湯低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺間質(zhì)膠原沉積改善較明顯，詳見(jiàn)圖3。

3.4 大鼠氧化和纖維化相關(guān)指標(biāo)活性/含量變化

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中SOD活性顯著降低，血清中MDA含量和肺組織中HYP含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清中SOD活性顯著升高，血清中MDA含量（掃日勞-4味湯中劑量組除外）和肺組織中HYP含量（掃日勞-4味湯高劑量組除外）均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見(jiàn)表4。

3.5 大鼠肺組織中炎癥因子和纖維化相關(guān)指標(biāo)含量變化

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ（掃日勞-4味湯高劑量組除外）含量均顯著降低（P<0.01），詳見(jiàn)表5。

3.6 大鼠肺組織中TGF-β1/Smad信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)水平變化

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高，Smad7 mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，Smad7 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），詳見(jiàn)表6。

4 討論

本研究制備特發(fā)性肺纖維化模型采用的是目前經(jīng)典的博來(lái)霉素誘導(dǎo)法。該法利用抗腫瘤藥博來(lái)霉素來(lái)引發(fā)肺纖維化，具有給藥劑量小、模型死亡率低等特點(diǎn)[12-14]。

目前，肺纖維化的治療方法和藥物十分有限，尋找和開(kāi)發(fā)治療肺纖維化的有效方法和藥物已成為醫(yī)學(xué)科研界的研究熱點(diǎn)之一。蒙藥掃日勞-4味湯主要由北沙參、拳參、甘草和紫草茸組成，臨床主要用于治療肺熱咳嗽等癥[18-19]。吡非尼酮是一種新的具有廣譜抗纖維化作用的吡啶酮類(lèi)藥物，能夠防止和逆轉(zhuǎn)纖維化和瘢痕的形成[20]，故本研究選用該藥作為陽(yáng)性對(duì)照藥。肺組織的形態(tài)學(xué)變化結(jié)果顯示，掃日勞-4味湯和吡非尼酮均可逆轉(zhuǎn)模型大鼠的肺纖維化進(jìn)展。

本研究測(cè)定了與肺纖維化發(fā)生發(fā)展相關(guān)的多項(xiàng)生化指標(biāo)，其中SOD作為生物體抗氧化系統(tǒng)中很重要的一種酶，其可抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過(guò)氧化[21];MDA的含量可以反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[22];HYP的含量可間接反映肺組織中膠原纖維含量的變化[23]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中SOD活性顯著低于正常對(duì)照組，血清中MDA和肺組織中HYP含量均顯著高于正常對(duì)照組，同時(shí)模型組大鼠肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維沉積明顯，說(shuō)明博來(lái)霉素誘導(dǎo)的特發(fā)性肺纖維化模型建立成功。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清中SOD活性顯著升高，血清中MDA含量（掃日勞-4味湯中劑量組除外）和肺組織中HYP含量（掃日勞-4味湯高劑量組除外）均顯著降低，說(shuō)明掃日勞-4味湯和吡非尼酮均可抑制和清除模型大鼠肺組織中的自由基，改善脂質(zhì)過(guò)氧化，從而減輕肺組織損傷。

已有研究表明，IL-1β、IL-6可以聚集炎癥因子，降低基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1的活性并抑制其合成[24]。HA是纖維化中變化最快、振幅較大的指標(biāo)，其含量若持續(xù)升高則提示纖維化未得到控制[25]。LN為基底膜中特有的非膠原性結(jié)構(gòu)蛋白，與纖維化活動(dòng)程度成正相關(guān)[26]。PC-Ⅲ和Col-Ⅳ在細(xì)胞內(nèi)合成后直接以前膠原的形式參與細(xì)胞外間質(zhì)的合成，與纖維化程度成正相關(guān)[27]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ含量均顯著升高。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ（掃日勞-4味湯高劑量組除外）含量均顯著降低，說(shuō)明掃日勞-4味湯和吡非尼酮均可減輕模型大鼠的炎癥反應(yīng)，改善其肺纖維化程度。

在肺纖維化形成過(guò)程中，除氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)外，TGF-β1/Smad信號(hào)通路已被證實(shí)具有重要作用[8-10，28-29]。TGF-β1可通過(guò)激活Smad蛋白促使成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化;Smad7可負(fù)調(diào)控TGF-β1，具有抑制TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用;細(xì)胞內(nèi)磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）的表達(dá)量與Smad通路的激活程度成正相關(guān)[30-32]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高，Smad7 mRNA的表達(dá)水平顯著降低。與模型組比較，掃日勞-4味湯各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，Smad7 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高，說(shuō)明掃日勞-4味湯和吡非尼酮均可下調(diào)模型大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 mRNA的表達(dá)水平，上調(diào)Smad7 mRNA的表達(dá)水平。

綜上所述，掃日勞-4味湯可以顯著改善特發(fā)性肺纖維化模型大鼠肺部病理改變，延緩并逆轉(zhuǎn)肺纖維化進(jìn)展，其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)，改善脂質(zhì)過(guò)氧化，下調(diào)TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)，上調(diào)Smad7 mRNA表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，掃日勞-4味湯低劑量的改善效果最好，其具體原因有待進(jìn)一步研究。本研究為進(jìn)一步開(kāi)展掃日勞-4味湯抗肺纖維化的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，也為肺纖維化的民族藥開(kāi)發(fā)提供了新的參考依據(jù)。

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（收稿日期：2021-02-18 修回日期：2021-05-21）

（編輯：鄒麗娟）