閆佳佳，萬 璐，吳 桐，鄭春英

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；3黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

快速溶劑萃取技術(shù)是近年發(fā)展起來的用于萃取固體或半固體樣品的前處理技術(shù)[1]，具有全自動(dòng)、提取效率高、節(jié)能環(huán)保等特點(diǎn)[2]。隨著在食品藥品活性成分提取中的廣泛應(yīng)用，該技術(shù)已逐漸應(yīng)用到黃酮[3]、生物堿[4]、酚類化合物[5]等活性成分的提取中。關(guān)于快速溶劑萃取技術(shù)在多糖提取中的應(yīng)用報(bào)道較少[6]，因此該技術(shù)在多糖提取方面還需要進(jìn)行深入研究。

豬苓(Polyporus umbellatus)及茯苓(Poria cocos)是2種常用食藥用真菌，分別為多孔菌科真菌豬苓及茯苓的干燥菌核[7]，有著悠久應(yīng)用歷史[8]。豬苓具有抗菌[9]、抗腫瘤[10]、抗炎[11]、抗病毒[12]、利尿[13]、護(hù)肝[14]等作用，其主要活性成分為豬苓多糖[15]、麥角甾醇[16]、生物堿[17]、甾體類化合物[18]等。茯苓具有利尿[19]、抗炎[20]、抗菌[21]、抗氧化[22]、抗腫瘤[23]、鎮(zhèn)靜[24]等作用，其主要活性成分包括茯苓多糖[25]、脂肪酸[26]、三萜類化合物[27]、甾體類化合物[28]等。在上述2種食藥用真菌活性成分中的多糖成分，因具有多種活性作用而備受關(guān)注[29]，并可作為食品的主要生產(chǎn)原料用于功能性保健食品的開發(fā)應(yīng)用[30]。

豬苓多糖及茯苓多糖常用的提取方法包括熱水提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶提法等[31]，但上述方法存在提取效率低、提取時(shí)間長等缺點(diǎn)[32]。為提高這2種食藥用真菌多糖成分的提取率，并高效分析其多糖成分，筆者在前期研究的基礎(chǔ)上[33]，采用快速溶劑萃取法對豬苓及茯苓的多糖成分進(jìn)行提取，以單因素及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選快速溶劑萃取法提取2種食藥用真菌多糖的最佳工藝條件，以期為食藥用真菌多糖的研究提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬苓、茯苓購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，經(jīng)黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鄭春英教授鑒定為豬苓、茯苓。

供含量測定用葡萄糖對照品，純度＞99.8%，Amresco。

1.2 主要儀器

P/N 10503型快速溶劑萃取儀，美國Applied Separations生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 脫脂供試品的制備 分別取2種食藥用真菌樣品適量，加入乙醇（按料液比1:8加入），熱回流2 h，濾液棄去，取藥渣低溫干燥，即得脫脂供試品，備用。

1.3.2 2種食藥用真菌多糖的含量測定 采用蒽酮-硫酸法測定2種食藥用真菌多糖的含量[34]。以葡萄糖為對照，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算2種食藥用真菌多糖的含量[35]。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

（1）PSE萃取溫度對2種食藥用真菌多糖的影響。精密稱取1.3.1項(xiàng)各樣品3.0000 g，置于PSE萃取池中，PSE萃取參數(shù)為壓力90 bar、提取時(shí)間20 min、循環(huán)2次，分別在70、80、90、100、110℃下，制備豬苓多糖、茯苓多糖萃取液，合并萃取液，采用1.3.2項(xiàng)的方法測定豬苓多糖和茯苓多糖的含量。

（2）PSE萃取壓力對2種食藥用真菌多糖的影響。按1.3.3（1）取樣，操作，PSE萃取參數(shù)為提取時(shí)間20 min，循環(huán)2次，溫度100℃，分別在不同壓力(80、90、100、110、120 bar)下，制備豬苓多糖、茯苓多糖萃取液，步驟同1.3.3（1）。

（3）PSE萃取時(shí)間對2種食藥用真菌多糖的影響。按1.3.3（1）取樣，操作，PSE萃取參數(shù)為壓力90 bar，循環(huán)2次，溫度100℃，分別在不同萃取時(shí)間(5、10、20、30 min)，制備豬苓多糖、茯苓多糖萃取液，步驟同1.3.3（1）。

（4）PSE循環(huán)次數(shù)對2種食藥用真菌多糖的影響。按1.3.3（1）取樣，處理，PSE萃取參數(shù)為壓力100 bar，時(shí)間30 min，溫度110℃，根據(jù)不同的循環(huán)次數(shù)（1、2、3、4次）制備豬苓多糖、茯苓多糖萃取液，步驟同1.3.3（1）。

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的篩選結(jié)果，選擇并設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)的影響因素，PSE提取豬苓多糖和茯苓多糖的因素水平表見表1。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)篩選結(jié)果，在最佳提取條件下提取豬苓多糖和茯苓多糖，并與熱回流提取法進(jìn)行對比分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

經(jīng)分析測定，葡萄糖對照品線性方程為Y=7.6030X-0.0157（r=0.9996，線性范圍0.02～0.10 mg/mL）。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 PSE萃取溫度對2種食藥用真菌多糖的影響結(jié)果 由圖1可以看出，在一定萃取溫度范圍內(nèi)，2種食藥用真菌多糖含量與PSE萃取溫度具有正相關(guān)性。盡管萃取溫度能夠顯著影響多糖的提取率，但當(dāng)溫度增至一定程度時(shí)，豬苓多糖和茯苓多糖含量的增加并不顯著，甚至可能使多糖在高溫下發(fā)生降解。因此，本實(shí)驗(yàn)測定2種食藥用真菌多糖含量選擇PSE的最佳萃取溫度為110℃。

圖1 不同PSE萃取溫度對2種食藥用真菌多糖含量的影響

2.2.2 PSE萃取壓力對2種食藥用真菌多糖的影響結(jié)果由圖2可以看出，在一定壓力范圍內(nèi)，PSE萃取壓力與2種食藥用真菌多糖含量的關(guān)系趨勢均為先增加后降低，萃取壓力增高有利于多糖的溶出，但萃取壓力過高，則可能會(huì)促進(jìn)多糖的分解。因此，本實(shí)驗(yàn)測定豬苓多糖含量時(shí)選擇PSE的最佳萃取壓力為100 bar，測定茯苓多糖含量時(shí)選擇PSE的最佳萃取壓力為110 bar。

圖2 不同PSE萃取壓力對2種食藥用真菌多糖含量的影響

2.2.3 PSE萃取時(shí)間對2種食藥用真菌多糖的影響結(jié)果 由圖3可知，2種食藥用真菌多糖的含量均隨著PSE萃取時(shí)間的增長而增加，兩者呈正相關(guān)性。盡管萃取時(shí)間能夠顯著影響多糖的溶出，但在一定萃取時(shí)間內(nèi)，多糖的溶出會(huì)達(dá)到平衡，因而持續(xù)增加PSE的萃取時(shí)間并不能使2種食藥用真菌多糖的提取率顯著增長。本實(shí)驗(yàn)測定豬苓多糖含量時(shí)選擇PSE最佳萃取時(shí)間為20 min，測定茯苓多糖含量時(shí)選擇PSE最佳萃取時(shí)間為25 min。

圖3 不同PSE萃取時(shí)間對2種食藥用真菌多糖含量的影響

2.2.4 PSE循環(huán)次數(shù)的篩選結(jié)果 由圖4可知，PSE循環(huán)次數(shù)對2種食藥用真菌多糖的含量增長影響并不明顯，循環(huán)次數(shù)并不是影響對豬苓多糖和茯苓多糖含量的主要因素，若多次循環(huán)萃取，高溫、高壓、長時(shí)間萃取還可能導(dǎo)致多糖的降解。根據(jù)實(shí)際操作情況設(shè)定PSE循環(huán)次數(shù)為2次。

圖4 不同PSE循環(huán)次數(shù)對2種食藥用真菌多糖含量的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)表2結(jié)果及表3的方差分析可知，PSE萃取豬苓多糖的最佳工藝條件為A3B2C2，PSE溫度影響極顯著、時(shí)間影響顯著、壓力影響不顯著。PSE萃取茯苓多糖的最佳工藝條件為A3B3C3，PSE溫度影響顯著、時(shí)間和壓力影響不顯著。盡管PSE萃取溫度能顯著影響2種食藥用真菌多糖的含量，PSE萃取時(shí)間能顯著影響豬苓多糖的含量，但考慮到持續(xù)增加提取溫度和延長提取時(shí)間可能導(dǎo)致多糖的降解，最終確定豬苓多糖最佳PSE提取條件為萃取溫度110℃，萃取壓力110 bar，萃取時(shí)間20 min，循環(huán)2次；茯苓多糖最佳PSE提取條件為萃取溫度110℃，萃取壓力120 bar，萃取時(shí)間25 min，循環(huán)2次。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4結(jié)果可知，采用PSE提取工藝提取2種食藥用真菌多糖，其提取率與傳統(tǒng)熱水提取法相比有顯著提高，從而驗(yàn)證了篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表4 提取方法比較結(jié)果(n=3) mg/g

3 結(jié)論

筆者以食藥用真菌豬苓和茯苓為研究對象，旨在借助PSE萃取技術(shù)的高溫、高壓、高效等特點(diǎn)，改善常見的多糖提取方法存在的提取時(shí)間長、提取效率低等弊端[32]，以便高效提取2種食藥用真菌多糖成分，并采用單因素及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選了PSE法提取多糖的最佳工藝條件。研究結(jié)果表明，采用PSE法提取豬苓多糖成分的最佳工藝條件為萃取溫度110℃，萃取壓力110 bar，萃取時(shí)間20 min，循環(huán)2次；采用PSE法提取茯苓多糖成分的最佳工藝條件為萃取溫度110℃，萃取壓力120 bar，萃取時(shí)間25 min，循環(huán)2次。上述結(jié)果表明，PSE萃取法提取2種食藥用真菌多糖與傳統(tǒng)的提取方法相比2種多糖含量有顯著提高。

4 討論

食品活性成分檢測需要運(yùn)用快速、靈敏的分析技術(shù)。PSE法作為一種快速前處理技術(shù)在很多食品分析中進(jìn)行了應(yīng)用，Rizwan等[36]采用PSE法提取食品級(jí)辣椒果實(shí)中的酚類化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同萃取溶劑及萃取溫度對酚類化合物的提取率影響顯著；Niyaz等[37]采用PSE法提取茶和咖啡中的甲基黃嘌呤，發(fā)現(xiàn)萃取溫度及萃取溶劑對甲基黃嘌呤的提取率影響顯著。盡管PSE技術(shù)的應(yīng)用開展較為廣泛，但其在多糖樣品提取中的應(yīng)用并不多見，其中王宇晴等[38]采用PSE法提取靈芝多糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萃取溫度及萃取時(shí)間對靈芝多糖的提取率影響顯著。因此，筆者在前期工作的基礎(chǔ)上，將PSE法系統(tǒng)應(yīng)用于豬苓多糖和茯苓多糖的提取，結(jié)果表明，萃取溫度及萃取時(shí)間對豬苓多糖及茯苓多糖的提取率影響較為顯著，考慮到持續(xù)增加提取溫度和延長提取時(shí)間可能導(dǎo)致多糖的降解，筆者優(yōu)選PSE法提取多糖的最佳工藝條件，從而充分證明了PSE法適用于食藥用真菌多糖的快速提取，為食藥用真菌多糖的提取提供了一種新方法，也為PSE法的廣泛應(yīng)用提供了參考。